湖南省玉竹叶斑病病原菌的分离鉴定

引用格式：，等.省玉竹叶斑病病原菌的分离鉴定[J].农业科学，2025（6）：72-74，84.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.012

中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2025）06-0072-03

Identification of the Pathogen Causing Leaf Spot in Polygonatum odoratum in Hunan Provi

XU Wen-jing1，YUAN Ye²，HUANG Yan-ning²，CAI Liu²，XU Rui²，LU Ying （1.HunanAgriculturalUniversityangsha428，PRC;2.HunanIstituteofNuclearAgricultureSciencesdne HerbalMedicines，Changsha，PRC）

Abstract：Thisstudyaims toidentifythepathogencausingeafspotinPolygonatumodoratuminHunanProvince.Thepathogen was isolated from the diseased leaves of P. odoratum by the tissue culture method，and its pathogenicity was verified according to Koch's postulates.Theisolatewasidentifedbymorphologicalobservationofcolonies，onidia，andhyphaeandmolecularbologicalethods. Theresultsshowedthattheobtained strainYZyhadthemorphologicalcharacteristicsconsistentwiththoseofFusariumequiseti. Specifically，thestrainpresentedcoloniescreamyhiteonthefrontandlightyellowatthback，focculentaerialhyphaepindleshapedorsickle-shapedmacroconidia，fewmicroconidia，andspherechlamydosporeswithroughsurfaces.Thesymptomscaused by thestrainnlaboratorywereconsistentwiththoseinthefeld.TemultilocusphylogeneticanalysisbasedoIS，EF-aadRPB1 showed that the strain shared the same clade （ 87% homology） with F. equiseti. Therefore， the pathogen causing leaf spot in P. odoratum is F. equiseti，which provides reference for the effective control of this disease.

Key words： Polygonatum odoratum; leaf spot; isolation and identification; Fusarium equiseti

玉竹（Polygonatumodoratum）是一种药食两用植物[1-2]，为天门冬科黄精属，又名葳蕤、铃铛菜、地管子和甜草根等[3]。玉竹以地下根茎入药，新鲜肉质呈黄白色，须状根细长密集，广泛分布于我国多个地区[4，也是种植历史悠久的道地药材。玉竹味甘、性平，具有生津养胃、益气养阴和补肾润肺等功效[5]。近年来，玉竹的应用范围逐渐延伸至功能性食品、化妆品和保健产品等领域[6-7]

随着玉竹的药用价值被广泛认可，其市场需求持续增长，种植规模不断扩大。然而，在规模化栽培过程中，极端气候、栽培模式单一与管理不当等因素导致病害频发，其中又以真菌性病害为主，例如褐斑病、根腐病、锈病和灰霉病等[8-9]。2024年，省玉竹种植区发现一种严重的叶斑病，发病初期叶片出现圆形或不规则的褐色斑点，后期病斑逐步扩大，直至多个病斑相连致使叶片大面积枯死，造成当地玉竹产量和质量下降，严重制约相关产业的可持续发展。本研究以省玉竹产区典型叶斑病病叶为试验材料，分离纯化菌株后，通过形态学观察、致病性测定以及多位点（ITS、EF-lα和RPB1）系统发育分析，对菌株进行鉴定，以期为玉竹叶斑病防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1 试验材料

供试样本为2024年采集自省玉竹产区有典型叶斑病症状的玉竹叶片；致病性测定的供试植物为健康玉竹盆栽苗；供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯 200g 、葡萄糖 20g 、琼脂 15～20g 、蒸馏水 O

1.2 试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化选取有叶斑病症状的玉竹病叶，用无菌蒸馏水冲洗去除叶片表面杂菌，于病健交界处剪取叶片组织（ 3mm×3mm ），经 75% 无水乙醇浸泡30s后，用无菌水充分漂洗3次并用灭菌滤纸吸干残留水分。将消毒后的叶片组织接种在冷却凝固的PDA平板上，置于 28°C 恒温培养箱中培养3＼～5d，待平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取菌落边沿菌丝，接种于新的PDA培养基上，重复处理直至平板上形成单一菌落，将纯化后的菌落接种至斜面培养基， 28°C 恒温培养直至菌落长满斜面，置于 4^∘C 冷藏保存。

1.2.2形态学观察将分离纯化的菌株接种到PDA培养基上，在 28°C 的恒温培养箱中培养5＼～7d，待菌落长满整个平板后观察菌落颜色、菌丝生长状况等特征，同时挑取少量菌丝置于显微镜下观察孢子和菌丝形态并测量分生孢子大小

1.2.3致病性测定用健康玉竹盆栽苗来验证分离菌株的致病性。先用 75% 酒精擦拭玉竹叶片进行表面杀菌处理，用无菌牙签在玉竹叶片上制作伤口，然后将分离的菌株接种至PDA平板，培养5d后使用直径 5mm 的打饼器打饼，将大小一致的菌饼接种至玉竹叶片伤口处，以不作处理为对照，重复3次。将6盆盆栽置于相同生长环境下，每天观察植株并记录发病情况，发病后再次分离病原菌，比较其与接种菌株的形态特征是否一致。

1.2.4分子生物学鉴定使用真菌基因组DNA提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取分离菌株的DNA，采用通用引物（表1）ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8进行PCR扩增，反应体系（ 25μL ）： 2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL ，上下游引物各 1μL ，DNA模板 1.5μL 无菌水 9μL 。PCR扩增的反应条件： 94^∘C 预变性5min ; 94^∘C 变性 30s ， 55% 退火 30s ， 72% 延伸 45s 共30个循环； 72^∘C 延伸 5min ， 4^∘C 保存。将扩增产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行测序和序列拼接，将获得的序列上传至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST同源性比对，下载所需序列，使用MEGA7.0软件采用邻接法构建系统发育进化树，Bootstrap重复1000次。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

将分离得到的菌株命名为YZy，其菌落形态、孢子及菌丝显微特征如图1所示。该菌株在PDA平板上形成米白色菌落，气生菌丝较短，呈棉絮状，长度不超过培养血盖高度，菌落背面呈淡黄色。大分生孢子呈纺锤形或镰刀形，孢子较弯曲，分隔范围为2＼～6个，其中以3＼～4个为主。小分生孢子数量少，厚垣孢子呈球形且表面粗糙。根据分离菌株YZy的培养性状和形态学特征，初步确定该菌株为木贼镰刀菌（Fusariumequiseti）

2.2 致病性测定结果

将分离的菌株YZy接种于玉竹叶片上，如图2所示，接种7d后，接种处理组的玉竹叶片均出现病症，病斑呈圆形或椭圆形，病斑外围呈褐色，后期病斑逐渐扩大，与玉竹产区植株的田间发病症状一致，而对照组玉竹叶片未出现感病症状。选取发病的玉竹叶片再次进行分离鉴定，得到的菌株与接种菌株一致，表明经柯赫氏法则（Koch'spostulates）验证，菌株YZy为叶斑病的致病菌。

2.3分子生物学鉴定结果

使用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8序列引物对分离菌株YZy进行PCR扩增并测序，将测序结果上传至NCBI数据库进行BLAST比对。从比对结果中选取同源性较高的序列与YZy构建系统发育树，结果如图3所示，分离菌株YZy与木贼镰刀菌（FusariumequisetiMHl1）聚在同一分支，同源性达 87% ，结合形态特征最终确定省玉竹产区叶斑病的病原菌为木贼镰刀菌。

3 结论与讨论

木贼镰刀菌是一种土传真菌，通常被报道为植物病原菌，能够对多种植物造成危害[10-13]，可侵染植物叶、茎、根等多个部位，严重时会导致植物死亡，对农作物产量和品质均产生不良影响。木贼镰刀菌侵染能引发芝麻菜叶斑病[14]、烟草根腐病[15-16]马铃薯萎蔫病[17-18]、玉米茎腐病[19]、白菜枯萎病[20]豌豆根腐病[21]、火龙果茎腐病[22]和苦瓜叶斑病[23]等病害；此外，该病原菌具备侵染动物的能力，如赵楠等[24]在患黑鳃病的克氏原螯虾的鳃上分离得到了木贼镰刀菌。