水晶香柚茎段离体诱导培养条件初探

中图分类号：S666.3 文献标识码：A

Abstract：【Objective】To explore the suitable culture conditions virus-fre tissuecultureseedlings pomelo，inorder toscreenthe method eficientinductionadventitious budspomelo，providereferencefortheutilizationdevelopment pomelo germplasm resources sustainable healthy development in .【Methods】Adult Shui Jing Xiang pomelo branches were disinfected with varying NaClOconcentrations"Bycomparing thedata，the appropriate explant disinfection methods，coection season，themostappropriatehormoneratiorotstock seed disinfectionmethods fortissueculture wereselected.Micro bud grafting experiments werecarriedouttoanalyze thesurvival status microbud grafting.【Results】 The optimal disinfection method for the explants Shui Jing Xiang pomelo was 75% alcohol +5% NaClO disinfection for 20min twice；The best timeforstem segment colection suitable for in vitro induction culture was in summer;The MS solid medium supplemented with 1mg/L （20 6- Benzylaminopurine （6-BA） ， 0.05mg/L indoleacetic acid（IAA） 0.5mg/L （204号 gibberelin（GA3）was beneficial tothe germination adventitiousbuds.【Conclusion】The most suitablecultureconditions foradventitiousbudinduction grapefruitexplants werepreliminarilyscreenedout，therootstocksedculturemethodwas preliminarilydetermined.Thegrapefruit Seedlings Grafted bymicrobud grafting technologygrew wellInthefuture，the grafting survivalratecould be improvedbyimproving the grafting technology，soasturther enhancetheappicatio value.

Key words： Shui Jing Xiang pomelo； in vitro culture；hormone ratio；micro bud grafting

柑橘是重要的经济作物之一，国家统计局数据显示，2022年底我国柑橘种植面积已达2 995.81hm² 、年产量突破6000万t，占全球总产量的 1/3^[1-2] 。但近年来，随着柑橘种植规模的不断扩大，果园管理问题逐渐显现，尤其是废弃果园处理不当导致柑橘病害频发的问题[3]。目前，世界上已报道的柑橘病毒和类似病毒病普遍具有传播快、危害重、宿主终身带毒等特点，传统防治手段收效甚微[4]。在此背景下，微芽嫁接技术因能有效脱除柑橘体内中的多种病毒而备受关注[5]。茎尖组织培养是微芽嫁接的基础环节，一些研究表明，茎尖组织培养仍面临污染率高、芽体分化难等问题，这些内外部因素制约微芽嫁接技术在柑橘生产上的推广应用[6-7]。前人研究显示，使用 1%00HgCl₂ 虽能显著降低外植体的污染率[6]，但其高毒性限制了应用，相比之下，NaClO作为替代方案安全性更高，但需进一步优化处理参数。例如，李丽[8]（2014）发现，采用 5% 和 10% NaClO对柑橘外植体进行消毒结合 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚3一乙酸（IAA） +1.0mg/L 赤霉素（GA3）更有利于柑橘腋芽萌发；周海霞[9]（2010）研究认为，添加 1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 吲哚丁酸（IBA） +0.5mg/L GA3更有利于红江橙腋芽萌发。尽管如此，柑橘嫁接技术仍面临效率低下的问题，罗君琴等[10]（2011）报道其微芽嫁接萌发率仅为 0～20% ；隆雨薇[11]（2015）进一步指出微芽嫁接成活率不足 5% ，亟需技术突破。当前，柚类相关研究较少，尤其是消毒方法、激素配比与嫁接效率的系统性探索不足。本研究以水晶香柚为对象，筛选适宜的培养条件，旨在为后续微芽嫁接及培育柚类脱毒苗提供参考依据。

1材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为水晶香柚的成年态茎段，采自的柑橘种质资源圃，砧木种子为酸柚种子。

试剂： 75% 酒精、NaClO溶液（ 2.5% 和5.0% 、蔗糖、琼脂粉、6－苄氨基嘌呤（6一BA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（ GA₃ ）、MS培养基、MT培养基等。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体采集

选择晴天剪取水晶香柚生长健康的半木质化芽条，剪去叶片和刺装入洁净自封袋带回实验室，自来水冲洗、洗涤剂浸泡 10min ，再用流水冲洗干净。将枝条剪成 3cm 的带单芽茎段。

1.2.2 外植体消毒

根据NaCIO浓度及消毒时间的不同，共设置8种处理方法对水晶香柚茎段进行消毒处理，具体试验设计见表1。MS固体培养（ ΔMS+40.0g/L 蔗糖 +6.0g/L 琼脂）基中培养，培养温度 27± 1^∘C ，光/暗周期 16h/8h 。每组30段，3次重复。14d后统计污染率、褐化率和生长良好（未污染、未褐化）的外植体数。

污染率 （%）= 污染数/总数 ×100 褐化率 （%）= 褐化数/总数 ×100

1.2.3外植体采集季节筛选

分春（4月—6月）、夏（7月—8月）、秋（9月—10月）三季采集茎段，按照1.2.2中的消毒方式进行消毒和培养，10d后统计污染率。

1.2.4激素配比筛选

采用1.2.2和1.2.3筛选出的方法处理水晶香柚茎段，接种于下列含不同激素配比的MS固体培养基（见表2）中，每组接种30段，3次重复。培养温度 27±1^∘C ，光/暗周期 16h/8h 。14d后统计外植体的诱导率、平均出芽个数等。

诱导率 （%）= 诱导段数/未污染接种段数 ∵×100 平均出芽个数（个/段） Σ= 出芽总数/诱导段数

1. 2.5 砧木种子消毒

选取充实饱满的酸柚种子，按照表3的处理方式进行种子消毒。种子剥取外种皮消毒后置于MT固体培养基中培养。培养条件为温度 27±1^∘C 、暗培养。每组50粒种子，3次重复。14d后统计种子的污染率和发芽率。

污染率 （% ） 污染种子数/接种种子总数 ×100

发芽率 （%）= 萌芽且未污染种子数/未污染种子总数 ×100

1. 2.6 微芽嫁接试验

取培养诱导的外植体不定芽30个，与1.2.5中培养成功的黄化砧木进行微芽嫁接，嫁接后置于MT培养基 （MT+40.0g/L 蔗糖）中，利用滤纸桥法进行液体培养。培养温度 27±1^∘C 、光/暗周期 16h/8h 。观察嫁接苗生长情况及成活率。

2 结果与分析

2.1外植体不同采集季节、不同消毒方法的消毒效果比较

由表4可知，水晶香柚外植体茎段在不同消毒组合处理下的污染率和褐化率具有较大差异。依据NaClO消毒浓度可将处理分为两组，分别是组1（A、B、C、D）、组2（E、F、G、H）。将这两组进行组内比较，单次消毒的污染率都很高，经两次NaClO消毒（D、H组合）的污染率明显降低，都在 30% 以下，但是随着NaClO消毒时间的增加污染率降低，褐化率却随之升高；两组间比较， 5% NaClO处理的试验组整体污染率低于 2.5% 浓度处理的试验组，褐化率则相反，组2高于组1。单看污染率和褐化率，两者呈负相关，无法直接从平均值得出最佳消毒效果值。因此，根据表5统计的未污染、未褐化数据进行排名得出处理组H为最佳的消毒方式，该方式消毒后的正常生长茎段数最多，其次是处理组D，处理组F、G并列第3；从表4的统计数据还可以看出，不同采集季节的污染率和褐化率平均值差距在 10% 以内，相对而言夏季采集的外植体茎段的污染率和褐化率较低，秋梢次之，春梢最高。因此，用于外植体离体诱导培养的茎段最佳采集季节为夏季。