浅谈如何制作高质量的术中快速冰冻切片

【摘要】快速冰冻切片是一种辅助病理医师对术中未固定组织进行快速诊断的方法，可以直接影响临床医生手术方案。与常规诊断相比，术中快速诊断可以缩短诊断时间，但术中快速切片较常规石蜡切片影响因素多，导致切片难度相对增大，对术中诊断医师是一种挑战。一张高质量的快速冰冻片可以大大地提高诊断的准确率。本人就根据个人的工作经验总结出快速冰冻切片的流程及相应的个人心得，同时对常见问题及处理方法进行描述，旨在交流经验心得，以便于制出更高质量的冰冻切片。

【关键词】冰冻切片，实验步骤，个人心得，高质量

A brief discussion on how to make high-quality intraoperative frozen sections

ZHOU Qin

Department of Pathology， Second Affiliated Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310000， China

【Abstract】Making rapid frozen sections is a method to assist pathologists in rapid diagnosis of unfixed tissues during operation， which can directly affect the operation plan of clinicians. Compared with conventional diagnosis， intraoperative rapid diagnosis can shorten the time of diagnosis. However， there are many factors affecting the intraoperative rapid section compared with conventional paraffin section， resulting in a relative increase in the difficulty of slicing， which is a challenge for intraoperative diagnosticians. A high-quality rapid frozen section can greatly improve the accuracy of diagnosis. Based on my personal work experience， I summarized the process of making rapid frozen sections and the corresponding personal experience. Meanwhile， I described common problems and treatment methods， in order to exchange experience， so as to facilitate the production of higher-quality frozen sections.

【Key Words】Frozen section； Experimental procedure； Personal experience； High quality

快速冰冻切片是一种在低温条件下快速将组织冷却到一定硬度，然后经过组织切片、固定、染色、脱水、封片等过程，并进一步制作成玻片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，故多应用于手术中的快速病理诊断。快速冰冻切片可以很好的保存类脂和脂肪组织，在组织化学上显示酶的活性，其有助于免疫荧光的研究。目前病理实验室多采用低温恒冷箱冷冻切片法，即恒温冰冻切片法。快速冰冻切片的优点很多，但也存在不可忽略的缺点，其确诊率比石蜡切片低，且有一定的延迟诊断率和误诊率。主要原因可归为：①短时间内需要作出诊断，难度很高；②取材具有局限性，组织需要精准取材，准则的找出病灶；③冰冻切片的质量相对石蜡切片低。随着临床手术对术中病理诊断需求的越来越大，快速准确的术中诊断越来越被重视，除了诊断医生取材和阅片等方面的人为因素外，若冰冻技术员切片质量差，将会直接影响诊断医生的阅片和判断，最终将会影响手术医生的手术方式。下面主要根据个人平时工作中的经验，浅谈一下快速冰冻切片过程中的心得体会。

1 冰冻切片的步骤及个人心得

1.1 标本接收登记

冰冻标本接收多采用核对姓名及病案号的方式进行。医生与技术员双人核对登记，核对病人信息和标本袋数。目前我们实验室已采用无纸化的方式进行扫码接收与登记，确保正确核对患者身份，降低出错率。

1.2 取材

取材时，取材台面和器械要保持干净无污染，含水或血较多的组织，要用干纱布将组织擦干，以防切片上有大量空洞和冰晶。尽量避开组织坏死、淤血及脂肪区域，剔除线头、毛发、硬骨及钙化组织，防止其损伤刀片、刀座及防卷板[1]。不要挤压组织，使其尽可能保持原有形态。组织的大小厚度要适中，避免过大过厚，大小最好在10～20mm，厚度一般1mm左右。组织越大、越厚，冷冻速度越慢。组织的取材可以用两个字概括：快，准。高年资医生需根据手术医生申请的要求精准取材，包括明确肿瘤性质的肿瘤取材、肿瘤是否完整切除的切缘取材等。

当然不是所有的组织都适宜做术中冰冻切片，也有很多组织是不合适做的，个人总结如下：①该类组织需做术中快速冰冻切片：a.术前无法通过活检明确性质，只能依赖术中活检确定性质，且性质的不同能影响手术决策情况的组织；b.确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织的残留；c.确认切除的组织来源，如甲状旁腺以及异位组织等；d.了解肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否侵犯相邻组织、有无区域淋巴结转移等。②该类组织不宜做冰冻切片：a.钙化组织、脂肪组织、质硬的骨组织和其他无法切片的异物等；b.怀疑是恶性淋巴瘤组织；c.长径≤0.2cm的组织；d.术前就可通过穿刺获得的活检组织；e.需要依据核分裂象计数来判断肿瘤性质的组织；f.主要依据生物学行为特征而不能依据组织形态来判断性质的肿瘤组织；g.具有传染性的组织，如患有乙肝、结核、病毒性肝炎、梅毒、艾滋病等疾病的组织，因其存在很大的风险和危害，不大建议做术中冰冻切片。

1.3 包埋

对于包埋，建议需要选择合适的包埋剂。不同的包埋剂，它们的收缩度、软硬度、韧性方面等差别很大，对组织的冷冻速度影响很大。根据平时工作中积累的经验，个人发现普通胶水和化学糨糊的包埋效果较好，目前在冰冻切片中已被广泛运用。包埋时，建议先在已提前预冷过的样本托上加入少量的包埋剂，等到大概有3/4冻住后再把取材好的组织进行包埋，后将样本托放置于冰冻台冷冻。包埋时需注意包埋剂不可把样本托全部放满，最好能够留有1/4以上的空间，包埋剂加的太多，会影响冷冻速度，影响切片质量。

1.4 设温

恒温冷冻切片机腔内温度一般设置在-25℃～ -14℃，并且应长期处于恒温冷冻状态，因经常开关机器电源，易造成压缩机损伤。不同的冷冻温度，影响组织的软硬程度，并直接影响最终切片的质量。韧硬或细胞致密的组织宜设置较高的温度，温度过低易导致组织变硬，切片易褶皱，如脑组织、淋巴结、子宫肌瘤等，温度设置在-15℃～-10℃；软嫩的组织宜设置较低的温度，温度过高会使组织堆积且难以铺展，导致切片不完整，如富含脂肪的组织，建议温度设置在-35℃～-25℃，甚至可以更加低；其他质地中性的组织，温度设置在-25℃～-16℃[2]。

1.5 切片

冰冻组织切片时，一般选择一次性刀片。切片的具体步骤如下：①安装样本托；锁紧切片手轮，将样本托夹紧固定在切片机的机头上面。。②组织修片；先采用粗修的方式对标本进行修片处理，注意进刀幅度不能太大，防止组织切崩，也避免对刀片、刀座和机头的损害。③切片；切片时需放下防卷板，缓慢匀速切片，以保证薄片完整平坦且没有褶皱。④切片制作；薄片切好后，用洁净的载玻片轻轻的粘附，使组织平整地吸附于载玻片，立刻放入固定液中固定。结束后锁紧切片手轮，卸下样本托。需要注意，无论是放置还是取出样本托，都需要提前锁紧切片手轮，以防止刀片割伤。

1.6 固定

组织的固定及其重要，保证切片得到充分且及时的固定是保证切片高质量的重要环节。固定的最佳时机就是将粘附好组织的玻片立刻放入固定液中固定。及时的固定，能有效破坏或者抑制各种细胞内酶的活性，沉淀或凝固细胞内的一些蛋白质，防止组织发生自溶与腐败，保持细胞与其生活状态时的形态相似[3-4]。若固定不及时，细胞将发生退变、变形，细胞核变大，胞质边界不清，细胞核的着色能力也会下降，染色将模糊不清，阅片效果不佳，影响最终的判读。冰冻固定液的选择有很多，但95%乙醇或甲醇是目前术中冷冻切片最常用的固定液，这两种固定液的固定作用较快，细胞收缩较小，染色较清晰，固定时间十秒左右。固定液最好一天一换，以保证新鲜干净，减少组织间的交叉污染。

1.7 染色和封片

组织固定后进行染色和封片，具体步骤如下：固定后水洗，苏木素染色1～2min，水洗，自来水或氨水溶液返蓝数秒，水洗，伊红染色数秒，水洗，梯度乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

染色和封片时的个人经验总结如下：①苏木素的选择及染色；选用过滤后的新鲜苏木素染液进行染色，可以减少苏木素结晶或沉渣的形成。苏木素染色以室温染色效果最好，且细胞易着色，组织染色时间相对较短，一般只需要1～2min。若超出时间染色仍很浅，多是因切片固定不及时引起细胞退变所致。②及时更换试剂；染色时，时刻关注片子的染色效果，随时调整苏木素和伊红的染色时间，同时及时更换苏木素、伊红、乙醇、二甲苯等试剂。③其他；染色过程，禁止用热吹风或高温加热进行组织固定、脱水，因其易导致细胞退变。

1.8 冰冻后再固定

冰冻医生诊断报告后，立刻将剩余组织放入福尔马林固定液中固定，避免暴露时间太久导致组织发生自溶现象。

2 术中冰冻切片的常见问题及解决方法

2.1 细胞内含有大量冰晶

正常情况下，细胞内大多数水分子以化合物的形式与蛋白质形成胶体，少数水分子呈现游离状态。当组织缓慢冷冻时，水分会从胶体状态的蛋白质中分解出来，形成大量的游离水分子，凝结成冰[5]。冰晶的出现，会把细胞间隙或者组织扩大，等切片快速放入固定液固定后，冰会融化成为水，导致周围组织收缩，组织结构发生变形且会留下大量的空洞，严重影响切片质量。造成组织冷冻时间过长的主要因素有：①取材时组织接触到水源导致组织表面水分过多；②包埋剂的量太多。

2.2 细胞核发生严重退变现象

组织固定不佳是导致细胞核发生退变现象的最主要原因。造成组织固定不佳的原因有固定液不佳或失效，组织固定不及时等。固定液未及时更换是组织固定不佳的重要因素。细胞核退变是完全可以避免的，个人总结如下：①及时更换固定液，保证固定液的固定效果。②固定要及时，玻片粘附好切片后立刻固定。

3 小结

与石蜡切片诊断相比，冰冻诊断的快速高效能够辅助手术医生判断在手术过程中的相关情况，有助于手术更加顺利进行。但冰冻诊断存在很多的局限性，尤其需要临床医生和病理医生之间更加密切的合作和沟通。冰冻诊断的局限性要求病理医生需有较高资质，同时技术员也要保证具有制作高质量冰冻切片的能力。一张高质量的冰冻切片能最大限度的避免漏诊和误诊，提高诊断准确率。高质量的冰冻切片要保证组织切片完整，无破损；厚薄均匀；无褶皱和无刀痕；组织内无冰晶；胞核和胞质对比分明、染色清晰适度、对比鲜明；细胞无肿胀和收缩，组织结构清晰；脱水透明洁净；封裱美观，胶水覆盖组织，没有溢胶等[6]。制作出一张高质量的冰冻切片，不仅需要技术员具有良好的专业技术知识，同时要保证在平时的工作中认真仔细。技术员只有在工作中，不断学习，不断进步，不断积累经验，不断提高自己，才能更好的胜任这项工作。

参考文献

[1] 余春艳，梅娟.快速准确术中新鲜标本冰冻切片方法探讨[J].淮海药，2016，34（3）：321-322

[2] 刘敏，罗彦丽，唐娟.病理术中冰冻切片特殊组织的切片技巧及应用体会[J].南通大学学报（医学版），2016，36（3）：225-226，227.

[3] 范玲丽.制作术中优质冰冻切片的方法及技巧[J].诊断病理学杂志，2022，29（04）：370-371.

[4] 傅杭州，方庆全，陈宏.一种创新病理冰冻切片的冰锤组件及染色加热组件在甲状腺术中冷冻切片中应用[J].中国医疗器械信息，2022，28（21）：43-46.

[5] 赵铁.术中快速冰冻切片的点滴经验[J].医学理论与实践，2012，25（9）：1032-1032.

[6] 丁伟，王德田.简明病理学技术[M].杭州：浙江科学技术出版社，2014.