高效液相色谱荧光检测器法快速测定水果中乙氧基喹啉残留量研究

摘 要：建立了高效液相色谱仪串联荧光检测器测定苹果、梨样品中乙氧基喹啉残留量的方法。水果样品加入抗坏血酸后进行混合匀浆制样，向样品中加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液，在碱性条件下经正己烷进行3次提取，合并提取液氮吹至干，用含有抗坏血酸的乙腈复溶，采用液相色谱荧光检测器法上机测定，外标法定量。荧光检测器激发波长365 nm，发射波长435 nm，流动相采用乙腈∶水=65∶35。结果表明，本方法在2.00～200.00 ng·mL-1浓度范围内呈现良好线性关系，线性方程为Y=1.06×104X-1.74×103，相关系数（r）为0.999 97。在0.02 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、1.00 mg·kg-1 3个浓度水平进行加标，并进行6次平行实验，回收率在81.09%～86.43%，相对标准偏差为1.18%～3.09%。本方法简单快速，提取效率高，仪器灵敏度高，准确度和重复性良好，可用于水果中乙氧基喹啉残留量的测定。

关键词：乙氧基喹啉；荧光检测器；水果

Rapid Determination of Ethoxyquin Residues in Fruits by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

ZHOU Zhijie， CHENG Xue， HAN Dongming

（Food and Drug Inspection and Testing Center of Jinan， Jinan 250000， China）

Abstract： To establish a method for the determination of residual ethoxyquin in apple and pear samples by high performance liquid chromatograph tandem fluorescence detector. The fruit samples were mixed with ascorbic acid and homogenized for sample preparation. 0.1 mol·L-1 sodium hydroxide solution was added to the samples. The samples were extracted by n-hexane for three times under alkaline conditions， and the liquid nitrogen was extracted and blown to dry. Dissolve with acetonitrile containing ascorbic acid， use liquid chromatography fluorescence detector method for machine measurement， and use external standard method for quantification. The excitation wavelength of fluorescence detector is 365 nm， the emission wavelength is 435 nm， and the mobile phase is acetonitrile∶water = 65∶35. The results showed that the method presented a good linear relationship in the concentration range of 2.00～200.00 ng·mL-1， the linear equation was Y=1.06×104X-1.74×103， and the correlation coefficient （r） was 0.999 97. Three concentration levels of

0.02 mg·kg-1， 0.20 mg·kg-1 and 1.00 mg·kg-1 were added， and six parallel experiments were carried out. The recoveries were 81.09%～86.43%， and the relative standard deviations （RSD） were 1.18%～3.09%. The method is simple and rapid， has high extraction efficiency， high instrument sensitivity， good accuracy and repeatability， and can be used for the determination of ethoxyquin residues in fruits.

Keywords： ethoxyquin; fluorescence detector; fruit

乙氧基喹啉又名虎皮灵、山道喹，是一种在饲料、食品领域广泛应用的抗氧化剂。在饲料中添加可以防止饲料中维生素、蛋白质、脂肪的氧化或变性，从而起到防霉作用[1-3]；作为果蔬保鲜剂使用时，常用在梨类水果、苹果等的表面，或加到果蔬包装纸、纸箱中，通过熏蒸起到保鲜作用，对苹果虎皮病、梨的黑皮病等有较好防治作用[4-5]。

乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EQ）化学名称为6-乙氧基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢化喹啉，通过清除自由基中断氧化过程来发挥抗氧化作用，作为一种成本低且效果稳定的抗氧化剂，其对维生素保护效果较好[6]。但随着人们对食品安全关注度的持续提升，近年来各国对乙氧基喹啉的危害性评估审查持续进行。2017年欧盟暂停乙氧基喹啉在饲料中使用，并于2022年通过2022/1375号法规，全面禁用乙氧基喹啉作为饲料添加剂，并且禁止进口任何投喂过含该物质饲料的农产品。韩国食品和药品安全部（Ministry of Food and Drug Safety，MFDS）对水产品中乙氧基喹啉和二聚乙氧基喹啉也设置了最大残留限量（甲壳类0.2 mg·kg-1，鱼类0.1 mg·kg-1），并要求于2022年7月1日起对进口鱼类水产品中乙氧基喹啉进行检查[7]。乙氧基喹啉通常以对氨基苯乙醚和丙酮作为原料进行合成，研究表明产物中的对氨基苯乙醚残留可能存在致癌风险，同时乙氧基喹啉的转化产物乙氧基醌亚铵（Ethoxyquin Quinone Imine，EQI）可能存在致畸、致突变等风险[8-10]；也有研究表明乙氧基喹啉在饲料中应用会影响鱼类代谢和体内微生物多样性，并在水体中富集对环境微生物群落造成一定影响，可能对消费者产生次级生物危害[11-12]。乙氧基喹啉在饲料产品和水果中的广泛使用，都会造成乙氧基喹啉在农产品中的残留，最终对人体造成一定隐患和影响。

目前根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014），我国对乙氧基喹啉的限量规定为在经表面处理的鲜水果中最高残留限量为

1 mg·kg-1。乙氧基喹啉常见的检验方法包括高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13-16]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）[17-18]、液相色谱串联质谱法（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）[19-20]、气相色谱串联质谱法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[21-22]等。LC-MS、GC-MS检测方法虽然有灵敏度高、定性准确的优点，但仪器维护成本高，使用条件要求相对复杂，使用液相色谱可实现对乙氧基喹啉的快速定量分析，结果准确性、重现性良好。高效液相色谱可与紫外检测器（Ultraviolet Detector，UV）、二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD）、荧光检测器（Fluorescence Detector，FLD）串联，实现对不同性质化合物的检测分析，通常荧光检测器灵敏度高于紫外检测器，因此选择高效液相色谱与荧光检测器结合使用[23]。

本研究选取苹果和梨两种基质，建立了高效液相色谱荧光检测器法测定水果中乙氧基喹啉的方法，实验结果表明该方法有良好的准确性和重复性，应用于水果样品检测的同时，也为进一步监测其他种类食品中乙氧基喹啉的残留情况提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果、梨样品均购于超市。

抗坏血酸、氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、正己烷（色谱纯，Fisher）；乙氧基喹啉标准溶液（CAS号：91-53-2，100 μg·mL-1，扩展不确定度3%，坛墨质检科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪（配有荧光检测器）；WS-100D振荡器（北京Wiggens公司）；3K15离心机（10 000 r·min-1，德国Sigma公司）；24位N-EVAP氮吹仪（可控温，美国Organomation公司）；AR2140万分之一电子天平（上海奥豪斯公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取500 g水果样品可食部分，加入10 g抗坏血酸，用组织捣碎机粉碎混匀至浆状，样品装入洁净容器中，密封，最好现制现测，若无法立即测定，则放置于-18 ℃冷冻避光保存，尽快测定。

1.3.2 试样提取

称取5 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液5 mL，涡旋30 s混匀，加入8 mL正己烷，涡旋5 s，振荡提取10 min，8 000 r·min-1常温离心5 min，将正己烷层转移至25 mL容量瓶中，继续按上述步骤将残渣重复提取2次，合并3次正己烷层于同一容量瓶中，加正己烷定容至刻度，混匀。

吸取5.0 mL正己烷提取液，于30 ℃下氮吹至近干，迅速加入含抗坏血酸的乙腈溶液5.0 mL，涡旋混匀30 s，经0.45 μm有机微孔滤膜过滤，得待测液上机。

1.3.3 标准溶液的配制

精确量取100 μL乙氧基喹啉标准溶液

（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，用含抗坏血酸的乙腈溶液溶解并定容至刻度，混匀得1 μg·mL-1标准溶液，转移至棕色玻璃容器中，-18 ℃保存，取适量上述标准溶液，用含抗坏血酸的乙腈稀释成2.00 ng·mL-1、4.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、20.00 ng·mL-1、50.00 ng·mL-1、100.00 ng·mL-1和200.00 ng·mL-1的标准系列工作液，现用现配。

1.4 仪器条件

色谱条件：Waters Symmetry C18液相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；荧光检测器激发波长：365 nm；发射波长：435 nm；流动相：乙腈+水=65+35；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

2.1 抗氧化剂的选择

乙氧基喹啉通过清除自由基起到抗氧化和保鲜作用，而苹果和梨切开后容易迅速氧化。在加标实验中，对直接匀浆处理的苹果和梨样品加入乙氧基喹啉标准物质进行提取，上机测试回收率均低于20%，且样品制备后与空气接触，24 h内变为褐色，说明苹果和梨氧化产生的自由基与乙氧基喹啉发生了反应[24]；在样品制备过程加入抗坏血酸后，回收率显著提升在70%以上，因此选择抗坏血酸作为抗氧化剂。随着样品制备后保存时间的延长，样品回收率呈下降趋势，在样品制备后约一周内回收率可保持在80%以上。

2.2 前处理方式选择

样品提取过程中，液-液萃取操作不当会引起乳化现象[25]。本试验过程中剧烈涡旋和低温均容易产生乳化现象，造成无法分层，影响提取效果，故样品加入正己烷后，涡旋时间设置为5 s，进而选择低频率振荡，以达到充分萃取，离心温度选择常温离心。

2.3 提取次数选择

提取次数、提取液体积对目标物提取效果有一定影响，本研究进行了10 mL正己烷提取2次和

8 mL正己烷提取3次两种提取方式对比，结果（图1）表明在苹果和梨基质中，提取2次回收率分别为72.22%、77.85%，相对标准偏差分别为2.17%、3.48%；提取3次回收率分别为81.09%、83.25%，相对标准偏差分别为1.18%、2.01%，表明8 mL提取液重复提取3次提取效果较好，因此选择提取3次。