16S rDNA鉴定腐败椰果罐头中的微生物

摘 要：以腐败椰果罐头为试材，选用4种培养基分离纯化腐败椰果罐头中的细菌，扩增细菌16S rDNA，对16S rDNA序列进行同源比对，并构建系统进化树，鉴定细菌种属。结果显示，从腐败椰果罐头中分离得到38株分离菌，经16S rDNA分子生物学方法鉴定为Paenibacillus humicus、Staphylococcus warneri、Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis。

关键词：腐败椰果罐头；16S rDNA；细菌；鉴定

Identification of Microorganisms in Spoiled Coconut Cans by 16S rDNA

SONG Meiling1， GUO Sanbao2， LIAO Li1， WU Qingyang1， HUANG Shenghe1*

（1.Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China; 2.Department of Pharmacy， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China）

Abstract： Taking spoiled coconut cans as test material， four kinds of culture media were selected to separate and purify bacteria in spoiled coconut cans， amplify bacterial 16S rDNA， compare the 16S rDNA sequences， construct a phylogenetic tree， and identify the bacterial species. The results showed that 38 isolates were obtained from spoiled coconut cans and identified by 16S rDNA molecular biology method as Paenibacillus humicus， Staphylococcus warneri， Sphingomonas sp.， Liquorilactobacillus satsumensis.

Keywords： spoiled coconut cans; 16S rDNA; bacteria; identification

椰果是醋酸杆菌利用椰子汁发酵制得的多糖类胶体，颜色微白，呈凝胶半透明状，具有较好的持水性、韧性和弹性，并富含优质的膳食纤维，因此被广泛加工成椰果罐头。椰果罐头因爽滑、多汁、脆嫩、细腻而有弹性的独特口感备受消费者的青睐[1]。

全国有上百家企业在罐头生产中出现过组织解体、糊化变质、酸败等质量问题[2]。许美玲等[3]通过菌落形态及生理生化指标，结合BD微生物自动鉴定仪鉴定了腐败黄桃罐头中的微生物为团泛菌和地衣芽孢杆菌，腐败草莓罐头中的微生物为地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；史振霞等[4]通过生理生化指标鉴定了腐败桃罐头中的微生物主要为凝结芽孢杆菌、黄色丝衣霉、蜡状芽孢杆菌等。与传统通过形态学观察、生理生化指标鉴定菌种方法相比，16S rDNA分子生物学鉴定方法具有较高的灵敏度，通过比对菌种间16S rDNA可变区的特异性核苷酸序列，鉴定细菌种属[5]。16S rDNA分子生物学鉴定方法已被广泛应用于食品中微生物的鉴定[6-8]，但目前使用该方法鉴定腐败椰果罐头中的微生物还鲜有报道。本实验以保质内腐败椰果罐头为材料，选取4种培养基培养、分离及纯化细菌，通过PCR扩增细菌16S rDNA，测序获得细菌16S rDNA碱基序列，在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中进行同源序列比对并构建系统发育树，鉴定细菌种属，以期为优化椰果罐头的杀菌方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

腐败椰果罐头样品由某企业提供。疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基和酸性肉汤琼脂培养基，北京陆桥技术责任有限公司；通用引物、DNA分子量标准Marker，上海生工生物工程有限公司；Taq酶、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，宝生物工程（大连）有限公司。

双人单面净化工作台，苏州博莱尔净化设备有限公司；电热恒温培养箱、智城恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；NanoDrop one超微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司；S1000™ Thermal Cycler普通PCR仪、凝胶成像系统，宝诚生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腐败椰果罐头中细菌的分离培养

从相关生产企业获得腐败及密封性良好的椰果罐头，使用75%酒精对外包装进行消毒，在超净工作台中取200 μL椰果罐头内容物分别涂布于疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基和酸性肉汤琼脂培养基上进行分离培养，倒置连续培养120 h，每组3个平行实验，每24 h观察记录实验现象。

1.2.2 腐败椰果罐头中细菌的纯化培养

观察菌落形态，不同形态菌落应选尽选，相似形态菌株至少挑选两株[9]，采用划线分离法分别接种于相应培养基，进行纯化培养。

1.2.3 细菌16S rDNA扩增

使用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR试剂裂解腐败椰果罐头中的细菌，获得细菌基因组DNA。使用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR扩增细菌16S rDNA基因序列，PCR均在25 μL标准反应体系中进行，反应体系为10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix（各2.5 mmol·L-1）2 μL，27F（10 μmol·L-1）、1492R（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模板1.5 μL，Taq酶（2.5 U·L-1）0.3 μL，灭菌纯化水16.7 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃复性30 s、72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，选择结果为阳性的样品，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.4 16S rDNA序列同源比对及构建系统进化树

获得的细菌16S rDNA基因序列在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中，用基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，Blast）进行同源序列比对，采用邻接法（Neighbor Joining，NJ）构建系统进化树，分析并确定腐败椰果罐头中细菌的种属。

2 结果与分析

2.1 腐败椰果罐头中细菌分离与纯化

腐败椰果罐头内容物涂布于疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基和酸性肉汤琼脂培养基，连续培养120 h，再经平板划线培养获得38株纯化菌株。

2.2 扩增细菌16S rDNA

利用16S rDNA通用引物扩增38株菌株16S rDNA序列，扩增产物大小为1 500 bp左右（图1），符合预期大小。

2.3 细菌16S rDNA同源序列比对

获得的细菌16S rDNA序列在NCBI中通过Blast进行同源序列对比，发现38株菌株属于4种不同菌，2株菌（A菌）与Paenibacillus humicus（登录号MT808854.1）相似度99.86%，7株菌（B菌）与Staphylococcus warneri（登录号MG972924.1）相似度99.86%，1株菌（C菌）与Sphingomonas sp.（登录号AM900776.1）相似度为100%，28株菌（D菌）与Liquorilactobacillus satsumensis（登录号KU060283.1）相似度99.86%，详见表1。

2.4 构建系统发育进化树

系统发育进化树构建结果如图2所示，A菌与Paenibacillus humicus（登录号MT808854.1）聚为一支，B菌与Staphylococcus warneri（登录号MG972924.1）聚为一支，C菌与Sphingomonas sp.（登录号AM900776.1）聚为一支，D菌与Liquorilactobacillus satsumensis聚为一支（登录号KU060283.1）。系统发育树结果与同源序列比对结果一致，初步推测A菌为Paenibacillus humicus，B菌为Staphylococcus warneri，C菌为Sphingomonas sp.，D菌为Liquorilactobacillus satsumensis。

Staphylococcus warneri为革兰氏阳性细菌，主要存在于在人体和动物皮肤黏膜表面[10-11]，一般不致病，但该菌可通过静脉注射等方法进入人体，引发多种疾病[12]。目前，在牦牛乳[13]、发病盔形溞[11]、发病罗非鱼苗[12]等中分离鉴定出了该菌，也有文献报道该菌还存在于发酵食品中，可发酵蔗糖和乳糖产酸[14]，导致食品变酸腐败。

Sphingomonas sp.为革兰氏阴性细菌，主要存在于常见于土壤和水生环境中，具有较强的生命力[15]，能够降解芳香族化合物、重金属等物质，在环境修复方面具有极高的应用价值[16]。Sphingomonas sp.在生长过程中可分泌鞘氨醇胶，其中的威兰胶无毒无害，具有较好的持水性，可长期保持果汁饮品中果肉的口感，还可延长果汁饮品的保质期。另外，威兰胶具有良好的增稠效果，且不易受pH值的影响，可作为添加剂添加于果冻、饮料、酸奶及果酱中[17]。Sphingomonas sp.还会产生琼胶酶，该酶可高效降解琼胶生成琼胶寡糖，琼胶寡糖因具有防腐功能，被广泛地应用于食品医药领域[18]。

Liquorilactobacillus satsumensis为乳酸菌，在生长过程中利用糖类产生乳酸。有文献报道，与部分乳酸菌相比，其发酵速度和产酸能力较弱，但其产生的发酵液酸度适中，在适宜消费者乳酸菌饮料酸度范围，是较好的果蔬类发酵微生物之一[19]。目前，鲜见对Paenibacillus humicus的研究。

3 结论

本文选用4种固体培养基对腐败椰果罐头中的细菌进行分离，得到38株细菌，经16S rDNA分子生物学方法鉴定为4种菌，分别为Phingomonas sp.、Liquorilactobacillus satsumensis、Staphylococcus warneri和Paenibacillus humicus。推测Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis是企业为保持产品较好口感以及适宜酸度，在椰果罐头中添加的两种菌；一线生产人员参与产品从原料到封口灭菌的生产过程，而人体皮肤黏膜表面存在Staphylococcus warneri，推测Staphylococcus warneri来自生产人员；Paenibacillus humicus的来源还需进一步研究。