食品安全中微生物计量的检测方法研究
作者: 甘美玲摘 要:本文系统总结了食品微生物计量检测技术的发展现状和应用前景。文中详细阐述了平板计数法、最大或然数法和显微镜计数法等传统检测方法的原理、优势和局限性。同时,重点分析了分子生物学检测、免疫学检测和生物传感器等现代快速检测技术的特点和应用进展。研究表明,尽管现代检测技术在检测速度、灵敏度和特异性等方面具有显著优势,但在成本和操作便利性方面仍有改进空间。未来,多种检测技术的优势互补和创新融合,将为食品微生物安全检测提供更加有力的技术支撑。
关键词:食品安全;微生物检测;快速检测技术
Research on Microbial Metrology Detection Methods in Food Safety
GAN Meiling
(Shenzhen Huimeikang Trading Co., Ltd., Shenzhen 518100, China)
Abstract: This article systematically summarizes the current development status and application prospects of food microbiological quantitative detection technology. The article elaborates in detail on the principles, advantages, and limitations of traditional detection methods such as plate counting, maximum probability counting, and microscopic counting. At the same time, the characteristics and application progress of modern rapid detection technologies such as molecular biology detection, immunological detection, and biosensors were analyzed in detail. Research has shown that although modern detection technologies have significant advantages in detection speed, sensitivity, and specificity, there is still room for improvement in terms of cost and operational convenience. In the future, the complementary advantages and innovative fusion of multiple detection technologies will provide stronger technical support for food microbiological safety detection.
Keywords: food safety; microbiological analysis; rapid detection technology
食品安全直接关乎公众健康和社会稳定。在食品的生产、加工、运输和储存过程中,存在微生物污染和腐败变质的风险。例如,食源性致病菌,如沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7等,可通过污染食品导致疾病暴发,从而威胁消费者健康[1]。因此,切实加强食品微生物安全检测对保障食品安全和维护公众健康具有重要意义。本文将系统综述食品微生物计量检测领域的最新进展。通过分析传统方法的优势与局限,评述分子生物学、免疫学等快速检测技术的原理及其在实际中的应用,并探讨新兴技术的发展前景,以期为相关领域的从业者提供有价值的参考,推动微生物检测技术创新,进而为保障食品安全和提升公众健康水平贡献力量。
1 传统微生物计量检测方法
1.1 平板计数法
平板计数法是食品微生物检测领域中应用最广泛且历史悠久的传统计数方法。其基本原理是将适当稀释的待测样品涂布于固体培养基平板表面,在特定条件下培养一定时间后,通过计数平板上形成的可见菌落数,并结合样品稀释倍数,换算出样品中微生物的浓度[2]。平板计数法的优势在于所需设备简单,仅需恒温培养箱和梯度稀释装置即可开展检测,大幅降低了实验室的资源投入。此外,该方法允许多人同时进行分析,具有通量较高,数据直观的特点,因此在基层实验室中应用广泛。然而,平板计数法也存在明显局限性。①检测周期长。常规平板需培养48~72 h才能形成可计数菌落。②仅能够检出可培养、生长状态良好的细胞,对于受损、休眠状态细胞则无法有效计数。③活菌检出限通常在100 CFU·g-1,灵敏度有限。④无法提供微生物的种属信息,易产生假阳性结果。尽管存在一些不足,但平板计数法凭借其成本低、适用范围广等优势,在食品工业中仍然是应用最普遍的微生物计数方法。
1.2 最大或然数法
最大或然数法(Most Probable Number,MPN)是一种基于概率统计原理的间接微生物计数方法。与平板计数法直接计数菌落数不同,MPN通过将待测样品接种到一系列梯度稀释的液体培养基中,然后根据各稀释度试管中菌生长的情况,利用MPN表进行估算,从而得出原始样品中微生物的最大或然数[3]。MPN的理论基础源自泊松分布。该方法假设微生物在试管中随机分布,则每个试管中微生物数量服从泊松分布。通过极大似然估计,可以推断出样品中微生物的浓度,而结果通常表示为一个置信区间。MPN的主要优势有以下3点。①检测灵敏度高,理论上可检出样品中1 CFU·mL-1的菌量。②所需设备简单,适用于资源有限的实验室。③可检测难以形成可数菌落的微生物。但MPN也存在明显局限性。例如,结果依赖于统计推断,导致准确性和重复性通常不如平板计数法;假设条件较为理想化,而实际样品中菌体易聚集,偏离随机分布;工作量大,单次检测的通量低;无法区分混合菌群,因此选择性较差。尽管存在这些局限,但MPN仍在低菌量样品的定量检测中发挥重要作用。
1.3 显微镜计数法
显微镜计数法是一种利用光学显微镜直接观察和计数微生物细胞的定量检测方法。操作时,将适当稀释的样品置于血球计数板或其他刻度计数室中,然后在显微镜下观察并计数视野中的细胞数量,通过结合样品稀释倍数和计数室体积,可以直接推算出原始样品中微生物的浓度。与依赖培养的平板计数法和最大或然数法不同,显微镜计数法无须等待微生物生长,可在接种后即刻获得结果,因此被广泛用于对微生物计数速度有较高要求的领域。显微镜计数法的主要优势有以下5点。①可直接观察微生物细胞的形态特征,有助于初步判断菌种类型。②检测速度快,从样品制备到结果获得仅需数十分钟。③所需设备简单,仅需光学显微镜和计数室。④可检测难以培养或生长缓慢的微生物。⑤可用于大范围筛查,快速估计菌量水平。然而,该方法也存在明显的局限性。①计数过程依赖人工操作,不同操作者之间的技能差异可能导致重现性差。②由于视野面积小,单次检测的通量低。③难以分辨细胞团聚,可能导致菌量被低估。④检出限较高,通常在104~105 CFU·mL-1。尽管存在一些不足,显微镜计数法仍在微生物检测领域中占据重要位置。对于需要快速检测和菌量水平较高的样品,显微镜计数法能够快速提供可靠的定量结果。然而,由于该方法依赖于人工操作,它在标准化、重现性和准确性方面不如仪器检测法。
2 现代快速检测技术
2.1 分子生物学检测方法
分子生物学检测方法是基于特异性核酸序列的检测,属于一类现代微生物快速检测技术。常用的分子生物学方法包括聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)、核酸序列杂交和基因芯片等。这些方法利用核酸分子的互补配对原理,通过特异性引物或探针与目标微生物的基因组DNA或rRNA互补结合,实现对特定微生物的定性或定量检测。例如,PCR技术利用特异性引物,在热稳定DNA聚合酶的作用下,实现目标基因片段的快速扩增。扩增产物可通过凝胶电泳进行检测。而qPCR在PCR基础上引入了荧光基团标记的探针,通过实时监测荧光信号的变化,实现扩增过程的实时动态定量。核酸杂交技术则利用标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交,形成特异性双链,并通过酶标等方式检测杂交信号。基因芯片技术将大量探针固定于一个支持物表面,通过与样品核酸的杂交,获得微生物组成和丰度信息。
相关研究发现,采用TaqMan探针qPCR技术对食品中沙门氏菌进行定量检测,灵敏度可达
1 CFU/25 g,且检测时间缩短至24 h以内[4];利用PCR技术对牛肉中大肠杆菌O157∶H7进行快速检测,在8 h内即可得到结果,为食品安全监控提供了有力工具[5]。分子生物学检测方法的主要优势有以下3个方面。①特异性强,可精确鉴定目标微生物。②灵敏度高,可检出极低丰度的菌种。③检测速度快,通常从样品制备到结果获得的时间在24 h以内。但这类方法也存在一定的局限性。例如,仪器设备昂贵,对实验室资质要求高;对核酸提取纯度要求高,食品基质易干扰;无法区分活菌和死菌,易产生假阳性结果。尽管存在局限,分子生物学方法仍凭借其独特优势成为食品微生物快速检测的主流技术。未来,分子检测方法有望与自动化样品制备、数字PCR、高通量测序等新技术深度融合。这种融合将进一步提高检测灵敏度和特异性,拓展多重检测能力,并全面提升食品微生物快速检测的效率和准确性,为保障食品安全提供更加有力的技术支撑。
2.2 免疫学检测方法
免疫学检测方法是基于抗原和抗体之间的特异性结合反应,用于实现食品中特定微生物定性和定量分析的一类技术。常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、免疫荧光技术等。这些方法的基本原理是利用特异性抗体与目标微生物表面抗原结合,然后通过酶标、荧光标记或磁性微球等信号放大系统,将抗原-抗体结合信号转化为可定量检测的信号值,从而实现微生物的定量分析。以三明治ELISA为例,操作开始时将特异性捕获抗体包被于微孔板上,加入待测样品后,其中的抗原会与捕获抗体特异性结合;洗涤除去非特异结合物后,加入另一种酶标记的检测抗体,形成“抗体-抗原-抗体”复合物;再次洗涤后,加入酶底物进行显色,通过比色或光度测量,可以定量分析抗原浓度,从而实现目标微生物的定量检测。有研究利用三明治ELISA建立了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A的直接定量分析方法,检测限达到0.3 ng·mL-1,线性范围为0.3~10.0 ng·mL-1,可实现食品中葡萄球菌肠毒素的快速定量检测[6]。免疫荧光技术通过荧光素标记的抗体与目标微生物抗原结合,利用荧光显微镜或流式细胞仪直接计数荧光标记的微生物细胞,实现快速定量检测。例如,应用免疫荧光流式细胞术对牛奶中的单核细胞增生李斯特氏菌进行定量分析,检测时间可缩短至2 h以内,检测限可达103 CFU·mL-1,为李斯特氏菌污染的快速筛查提供了有效工具。
2.3 生物传感器技术
生物传感器是一类集生物识别元件和信号转导元件为一体,可实现待测物的快速且特异性定量分析的现代传感技术。根据信号转导原理,生物传感器主要分为电化学、光学、压电等类型。其基本原理是利用生物识别元件(如酶、抗体、核酸和细胞等)与目标物特异性结合,然后将结合信号通过信号转导元件(如电极、光学装置、压电晶体等)转化为可定量的电信号、光信号或质量信号,从而实现对目标物的定量检测。
电化学生物传感器利用生物识别元件与待测物结合引起的电化学响应实现定量检测。例如,利用功能化石墨烯和纳米金颗粒修饰电极构建酶传感器,用于牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B的高灵敏检测,其检测线性范围为0.05~15.00 ng·mL-1,检出限低至20 pg·mL-1[7]。光学生物传感器通过测定生物反应过程中光信号的变化,实现对目标物的定量分析。例如,基于荧光量子点-抗体探针构建的光学免疫传感器可在1 h内实现鸡肉中沙门氏菌的快速定量检测,其检测的线性范围为103~106 CFU·mL-1,检出限为103 CFU·mL-1[8]。而压电生物传感器则利用压电晶体质量的变化,对生物反应过程进行实时监测和定量分析。
3 结语
食品微生物检测技术经历了从传统培养计数方法到现代快速检测技术的革新发展。虽然传统方法操作简便,但耗时较长。相比之下,现代检测技术,如分子生物学、免疫学和生物传感器技术,在检测速度、灵敏度和特异性等方面具有显著优势。未来,随着微纳技术、人工智能等新兴技术的深度融合,食品微生物检测将向着自动化、智能化、便携化方向发展。通过多种检测技术的优势互补和协同创新,将为食品安全提供更加全面、快速和精准的技术支撑,从而有效保障公众健康。
参考文献
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