北京市通州区即食非发酵豆制品微生物污染状况及致病菌分析

摘 要：目的：了解北京市通州区不同包装、不同采样场所即食非发酵豆制品微生物污染情况，为本地区食源性疾病的风险评估提供依据。方法：采集即食非发酵豆制品70份，采用GB 4789系列标准方法进行大肠菌群计数、菌落总数、致病菌的检测；对检测出的致病菌检测其毒力基因和血清分型，并进行药敏分析和PFGE分子分型。结果：预包装的微生物检测合格率均高于散装，预包装致病菌检出率低于散装，超市的微生物合格率高于网店和农贸市场。本次共检出致病菌14株，沙门氏菌5株；单核细胞增生李斯特氏菌4株，血清型为1/2a有3株，1/2b有1株，且所检测的6对毒力基因均为阳性；致泻大肠埃希氏菌5株，均携带astA毒力基因，为肠聚集性大肠埃希菌。结论：北京市通州区即食非发酵豆制品污染较为严重，部分豆制品中检测出了食源性致病菌，存在较高的食物安全隐患，相关部门应加强监管力度，保障食品安全。

关键词：非发酵豆制品；微生物污染；毒力基因；血清分型

Abstract： Objective： To investigate the microbial contamination of ready-to-eat non-fermented soybean products in different packaging and sampling sites in Tongzhou district， Beijing， and to provide a basis for the risk assessment of foodborne diseases in this area. Method： 70 copies of ready-to-eat non-fermented soy products were collected， and the coliform count， total number of colonies and pathogenic bacteria were detected by GB 4789 series standard methods. The virulence genes and serotyping of the detected pathogenic bacteria were detected， and the susceptibility analysis and PFGE molecular typing were performed. Result： The pass rate of prepackaged microbial detection was higher than that of bulk， the detection rate of prepackaged pathogenic bacteria was lower than that of bulk， and the microbial qualification rate of supermarkets was higher than that of online stores and farmers’ markets. A total of 14 strains of pathogenic bacteria were detected， 5 strains of Salmonella; 4 strains of Listeria monocytogenes， 3 strains of serotype 1/2a， 1 strain of 1/2b， and the 6 pairs of virulence genes detected were all positive; 5 strains of Escherichia coli causing diarrhea， all of which carry the astA virulence gene as enteroaggregative Escherichia coli. Conclusion： The pollution of ready-to-eat non-fermented soy products in Tongzhou district， Beijing is serious， and foodborne pathogenic bacteria have been detected in some soy products， which has high food safety risks， and relevant departments should strengthen supervision to ensure food safety.

Keywords： non-fermented soy products; microbial contamination; virulence genes; serotyping

大豆及其制品的蛋白质含量居植物蛋白之首，有防癌、护肝、降血压、增强免疫力等保健作用[1]，其含有的大豆异黄酮和大豆皂苷在治疗动脉粥样硬化、冠心病、抗肿瘤等方面有积极的效果[2]，越来越受到消费者推崇。但豆制品中所含丰富营养物质又为微生物提供了理想的生长条件，如果保存不当受到微生物的污染很容易大量增殖，会给消费者的健康带来极大的威胁[3]。即食非发酵豆制品日常消费量很大，包括豆腐、豆浆、豆丝、豆干、凉拌菜等，因为其直接入口的特点，致病微生物的污染会对消费者的健康造成极大的伤害。本研究基于2020年底对北京市通州区开展的一次即食非发酵豆制品的微生物污染状况监测，分析了北京市通州区不同包装、不同采样场所即食非发酵豆制品微生物污染情况，以期为当地食源性疾病的风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 即食非发酵豆制品样品采集

利用无菌操作技术在北京市通州区大型超市、农贸市场、网店采集即食非发酵豆制品共70份，采样量≥250 g/份，大型超市30份，农贸市场30份，网店10份，其中散装45份、预包装25份，采样后立即低温运送至实验室检测。

1.2 材料与仪器

革兰阳性/阴性需氧菌药敏检测板（上海星佰）；沙门氏菌诊断血清（丹麦SSI）；单增李斯特菌血清分型抗体（日本DenkaSeiken）；致泻大肠埃希氏菌核酸检测试剂盒（北京良润）；单核细胞增生李斯特氏菌毒力基因和分型引物，由上海生工合成；AscI和XbaⅠ限制性核酸内切酶（TAKARA）。

电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；VITEK2 COMPACT30全自动细菌生化分析系统（法国生物梅里埃公司）；普通PCR仪（美国BIO-RAD公司）；罗氏实时荧光定量PCR仪（Roche Diagnostics Ltd）；全自动DNA/RNA分析系统（QIAGEN）；脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司）。

1.3 同时期参比致病菌株

2020年6月—12月北京市通州区食源性疾病腹泻病例中分离的沙门氏菌；2018—2020年北京市通州区单核细胞增生李斯特氏菌病例监测中分离的菌株；2020年6月—12月北京市通州区食源性疾病腹泻病例中分离的致泻大肠埃希氏菌。

1.4 检测项目和方法

检验项目为菌落总数、大肠菌群计数、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和致泻大肠埃希氏菌，均按GB 4789系列标准[4-9]进行检测。致病菌鉴定均用全自动细菌生化分析系统VITEK2 COMPACT30。

1.5 致病菌分离株的分析方法

利用血清凝集方法测定血清型；用微量肉汤稀释法进行药敏分析；用PCR方法分析毒力基因；参考国家致病菌识别网技术规范将豆制品中分离的菌株与同时期通州区食源性疾病腹泻病例中分离的同类菌株进行PFGE分子分型。

1.6 结果判定

1.6.1 评价标准

参照《食品安全国家标准 面筋制品》（GB 2711—2014）[10]、《食品安全国家标准豆制品》（GB 2712—2014）[11]、《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[12]以及《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[13]评价豆制品微生物污染情况；数据统计应用SPSS 24.0软件，计数资料均用率表示，卡方检验，当P＜0.05时，表示差异具有统计学意义。

1.6.2 药物敏感性

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相应标准评价致病菌的药敏结果，获得相应敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）的结果。

1.6.3 PFGE图谱

用Bionumerics 7.6软件分析菌株间的亲缘性，采用非加权配对平均法，位置容许度为1.5%。

2 结果与分析

2.1 即食非发酵豆制品的微生物检测情况

样品共计70份，总合格率38.57%（27/70），菌落总数合格率38.57%（27/70），大肠菌群合格率85.71%（60/70）。致病菌检出率20.00%（14/70），其中5株沙门氏菌（7.14%），4株单核细胞增生李斯特菌（5.71%），5株致泻大肠埃希氏菌（7.14%）。

2.2 不同包装即食非发酵豆制品的检测情况

预包装菌落总数合格率显著高于散装样品（χ2=18.341，P＜0.05）；预包装大肠菌群合格率稍高于散装样品（χ2=2.180，P＞0.05）；预包装致病菌检出率显著低于散装样品（χ2=6.222，P＜0.05），具体数据见表1。

2.3 不同采样场所即食非发酵豆制品的检测情况

3类采样场所样品的合格率分别为农贸市场20.00%、超市56.67%、网店40.00%，差异有统计学意义（χ2=8.520，P＜0.05），见表2。

2.4 致病菌分离结果

2.4.1 沙门氏菌

（1）血清分型。5株沙门氏菌中2株为鼠伤寒沙门氏菌，1株为肠炎沙门氏菌，1株为阿姆斯特丹沙门氏菌，1株为德尔卑沙门氏菌。

（2）耐药情况。受试的15种抗生素中，所有菌株对亚胺培南、头孢西丁、庆大霉素、阿奇霉素和环丙沙星的敏感率为100%，对氨苄西林、氨苄舒等呈现不同程度的耐药性，见表3。

（3）PFGE分型。将豆制品中分离沙门菌株及同时期腹泻病例分离沙门菌株进行PFGE分析，菌株间条带相似度介于57.3%～100.0%，来源于市场的3号豆制品的菌株与来源于病例的2、3、4、5号菌株带型相似度为88.7%，来源于市场的1号豆制品的菌株与来源于病例的1号菌株带型相似度达77.4%，见图1。

2.4.2 单核细胞增生李斯特菌

（1）毒力基因及血清分型。分离出的4株单核细胞增生李斯特氏菌，3株血清型为1/2a，1株血清型为1/2b，所有菌株6对毒力基因（prfA、plcA、iap、hly、plcB、inlA）均为阳性。

（2）耐药情况。单核细胞增生李斯特氏菌在受试的15种抗生素中，对多数抗生素敏感，但对苯唑西林、环丙沙星、头孢西丁100%耐药，见表4。

（3）PFGE分型。将豆制品分离株及近3年病例检测出的菌株进行PFGE分析，菌株间条带相似度介于56.9%～90.9%。来源于豆制品的3号带型与来源于病例的6号带型只相差2个条带，相似度达90.9%，与7号带型相差3个条带，相似度达86.4%；来源于豆制品的2号带型与来源于病例的5号带型相差4个条带，相似度达80.0%，见图2。

2.4.3 致泻大肠埃希氏菌

（1）毒力基因及血清分型。5株致泻大肠埃希氏菌均携带astA毒力基因，为肠聚集性大肠埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）。