食品添加剂L-香芹酮的吸入遗传毒性评价

摘 要：目的：了解食品添加剂L-香芹酮对雾化剂参比烟液气溶胶遗传毒性的影响。方法：在雾化剂参比烟液中加入300 mg·L-1的L-香芹酮，选取气-液（琼脂）界面的全烟气暴露方式，暴露时间为30 min，通过Ames试验、染色体畸变试验和体外微核试验等遗传组合试验，对添加L-香芹酮后的雾化剂参比烟液气溶胶的遗传毒性进行评估。结果：与雾化剂参比烟液气溶胶相比，添加L-香芹酮后的雾化剂参比烟液气溶胶的5种菌株的细菌突变菌落数降低幅度为0%～39.6%（不含活化系统S9），而TA97a和TA102菌株的菌落数增加56.0%和2.4%，TA98、TA100和TA1535菌株的菌落数分别降低50%、27.9%和50%（含活化系统S9）；染色体畸变率降低0.6%；微核率降低1.55‰；但与阴性对照组相比，添加L-香芹酮后的雾化剂参比烟液气溶胶组的细菌回复突变试验、染色体畸变试验和微核试验等遗传组合试验的3项指标均符合阴性判断标准。结论：在本试验条件下，添加300 mg·L-1的L-香芹酮对雾化剂参比烟液气溶胶的遗传毒性影响较小。

关键词：雾化剂；参比烟液；L-香芹酮；气-液界面；遗传毒性

Genotoxicity Evaluation of Food Additive L-carvone

YAN Dawei1， LI Rui2， LU Chengwei1， GAO Yihan1*

（1.Department of Basic Research， Shanghai New Tobacco Product Research Institute Co.， Ltd.， Shanghai 201315， China; 2.Department of Pharmacology and Toxicology， Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203， China）

Abstract： Objective： To understand the effect of food additive L-carvone on the genetic toxicity of reference liquid aerosol. Method： Add 300 mg·L-1of L-carvone to the reference smoke liquid， select the full smoke exposure method at the air-liquid （agar） interface， set the exposure time to 30 min， and pass the Ames test， chromosome aberration test and in vitro micronucleus test to evaluate the genetic toxicity of the reference smoke liquid aerosol after adding L-carvone. Result： Compared with the reference smoke liquid aerosol， under the treatment of the reference smoke liquid aerosol containing L-carvone， the bacteria mutant colonies of the 5 strains varied from 0% to 39.6% （-S9） and the number of colonies of TA97a and TA102 increased by 56.0% and 2.4%， while the number of colonies of TA98， TA100 and TA1535 decreased by 50%， 27.9% and 50%， respectively （+ S9）. The variation range of chromosome aberration rate is 0.6%. The variation range of micronucleus rate is 1.55‰. However， compared with the negative control group， the three indexes of the genetic combination test of L-carvone added reference smoke liquid aerosol met the negative judgment. Conclusion： Under the test conditions， adding 300 mg·L-1 of L-carvone has little effect on the genetic toxicity of the reference e-cigarette liquid aerosol.

Keywords： atomization agent; reference smoke liquid; L-carvone; air-liquid interface; genetic toxicity

L-香芹酮是留兰香油的主要成分，含量占比在50%～60%，具有很浓郁的留兰香香气，其在食品香精、牙膏、硬糖、口香糖和各种饮料中有着广泛的应用[1-2]。近年来，随着雾化平台的兴起，L-香芹酮等香精香料的使用方式可改变为雾化吸入的方式摄取。L-香芹酮虽是食品级添加剂，一定剂量内经口摄入较为安全，但其吸入途径的安全性却鲜有报道，尤其是关于L-香芹酮吸入途径的遗传毒性。

有报道称消费者在电子烟烟液中违规添加四氢大麻酚等物质，引起多起健康事件，添加剂的吸入安全性已引起广泛关注[3]。同时，有研究表明不同的电子烟烟液气溶胶的细胞毒性具有较大差异，且与电子烟烟液中的添加剂密切相关[4-7]。虽然THORNE等[8]开展了电子烟烟液气溶胶的Ames试验，结果显示受试菌株未发生基因回复突变。MANOJ等[9]也未观察到在与卷烟等同的特定剂量下电子烟烟液气溶胶会引起细胞毒性和遗传毒性的情况。同时，AZZOPARDI等[10]也证明电子烟烟液气溶胶的细胞毒性相对传统卷烟气溶胶的细胞毒性较小，但对单一添加剂的吸入途径的遗传组合毒性评价还未见报道，尤其是添加后对烟液气溶胶整体的遗传毒性影响。因此，本文拟采用气-液（琼脂）界面暴露的方式，选取TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株和中国仓鼠肺细胞（CHL细胞）等受试体系，根据Ames试验、染色体畸变试验、体外微核试验等遗传毒性检测方法，本着风险最大化原则，选取美国香精和提取物制造商协会公认在烘焙食品中安全无毒使用L-香芹酮浓度的3倍（300 mg·L-1）[11]，对含有L-香芹酮雾化剂参比烟液气溶胶的遗传毒性进行初步评估，并与雾化剂参比烟液气溶胶进行比较，为L-香芹酮添加剂的合理安全使用提供参考和支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，来源于美国Moltox公司；中国仓鼠肺细胞，来源于中国科学研究院细胞库；A549人肺腺癌细胞，来源于复旦大学药学院。

琼脂粉（212304A级），美国BD公司；氯化钠（≥99.5%），海凌峰化学试剂有限公司；组氨酸（99%），北京百灵威科技有限公司；生物素（99%），北京百灵威科技有限公司；营养肉汤（CM1168B），英国OXOID公司；RPMI 1640细胞培养基（Lot2200921），美国Gibco公司；胎牛血清（Dbc0520），美国Hyclone公司；磷酸缓冲液（Lot2028925），美国Gibco公司；0.25%（w/v）胰酶-EDTA（0.25%），美国Gibco公司；丝裂霉素（99.7%），中国食品药品检定研究院；冰醋酸（≥99.5%），上海凌峰化学试剂有限公司；甲醇（≥99.5%），上海凌峰化学试剂有限公司；细胞培养皿（100 mm×20 mm），美国Corning公司；Tran swell培养板（12/24 mm），美国Costar公司；DMEM细胞培养基（Lot2120818），美国Gibco公司；无水乙醇（≥99.7%），国药集团化学试剂有限公司；DMSO（99.9%），美国Sigma公司；雾化剂参比烟液；上海新型烟草制品研究院有限公司配制；含300 mg·L-1 L-香芹酮的雾化剂参比烟液；上海新型烟草制品研究院有限公司配制。

X200AF吸烟机，上海帕夫曼自动化仪器有限公司；Mini Tank烟具，香港Mask King公司；LA2-6AX生物安全柜，新加坡ESCO公司；ECLIPSE TS100倒置相差显微镜，日本Nikon公司；BD240恒温培养箱，德国Binder公司；G-560E漩涡混合器，美国Scientific Industries公司；CKX41显微镜，日本Olympus公司；HERA CELL VIOS 160i CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司；移液器（5 mL、1 mL和200 μL），德国Eppendorf公司；5810R离心机，德国Eppendorf公司；Vi-cell XR细胞活力分析仪，美国Beckman Coulter公司；U570超低温冰箱，加拿大New Brunswick公司；3K30离心机，美国Sigma公司；气-液界面暴露皿，英国BAT公司自制。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌和细胞培养

取营养肉汤培养基5 mL，加入无菌试管中，将冷冻保存的TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37 ℃下振荡（100次/min）培养10 h。

CHL细胞培养基为含有10%（V/V）胎牛血清的RPMI 1640培养基，培养条件为37 ℃、5%浓度的CO2加湿培养。

1.2.2 气溶胶产生方式和暴露方式

将参比烟液（或含300 mg·L-1 L-香芹酮的参比烟液）装入Mask King电子烟烟具，烟具充电激活后，接入吸烟机。按照一定的抽吸模式（抽吸间隔30 s，抽吸流量55 mL，抽吸时间3 s，电子烟功率11.3 W）进行抽吸，在吸烟机和电子烟烟具间采用软管接入气-液界面暴露皿（图1），待细胞接种至Trans well培养板（或细菌接种至琼脂培养皿，然后将培养皿直接放入暴露小室）后，即可产生气-液（琼脂）界面暴露染毒，染毒时间为30 min（60口抽吸耗时，烟具单次充电最大抽吸口数），暴露的气溶胶浓度为电子烟烟液的全烟气[12]。

1.2.3 遗传毒性检测方法

（1）Ames试验方法。Ames试验中，将含

0.5 mmol·L-1组氨酸和0.5 mmol·L-1生物素溶液的顶层琼脂培养基按照0.4 mL/管分装于60个试管中（共分为阴性对照组、阳性对照组、参比烟液组和含L-香芹酮参比烟液组，每组测试5个菌株，每个菌株

3个平行），45 ℃水浴中保温，每管依次加入试验菌株增菌液0.2 mL，PBS或者S9混合液（需代谢活化时）1.0 mL，阳性对照组加入阳性物质溶液（敌可松、叠氮钠、甲磺酸甲酯或2-氨基芴），充分混匀，取80 μL迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀，置于培养箱，待平皿干燥后受试物组进行全烟气暴露。阴性对照组不作处理、阳性对照组给予各菌株的阳性对照品。暴露结束后置37 ℃培养箱内倒置培养72 h后观察结果。若阳性对照组的回复突变数是阴性对照组的3倍或3倍以上，则视为菌株阳性结果，如不符合，则视为阴性结果。

（2）染色体畸变试验方法。染色体畸变试验中，将CHL细胞接种在24 mm的trans well小室的顶侧，接种密度为2×105 cells/孔，1.5 mL/孔，底侧加入1.3 mL含有10%（V/V）胎牛血清的RPMI 1640培养液的培养基。细胞在37 ℃，5% CO2下培养24 h。阴性对照组不作处理；阳性对照组给予丝裂霉素（终浓度为0.2 μg·mL-1）；处理组进行全烟气暴露。在细胞收获前4 h，每皿加入15 μL浓度为20 μg·mL-1的秋水仙素，使秋水仙素的终浓度为0.2 μg·mL-1。秋水仙素处理4 h后，弃去培养液，加入0.5 mL 0.25%胰酶-EDTA消化细胞。待消化结束后，加入一定量的完全培养液终止消化，终体积为10 mL。取约

0.5 mL细胞悬液计数活细胞数。取剩下的细胞悬液离心后经0.075 mol·L-1氯化钾低渗、固定、滴片，干燥后Giemsa染色，干燥后封片待阅。记录染色体结构畸变细胞数和畸变类型，畸变类型包括断裂、缺失、交换、环状、三辐体、四辐体和粉碎等。裂隙和染色体数目畸变（多倍体和内复制）单独记录，不计入畸变率中。若细胞的染色体畸变率与阴性对照组存在显著性差异，则视为阳性结果，若不符合，则视为阴性结果。