碱韭总黄酮含量测定方法优选

摘 要：目的：筛选适用于测定碱韭总黄酮含量的试验方法，并对不同采集年份、不同部位碱韭总黄酮进行分析评价。方法：以芦丁为对照品，碱韭叶为试验材料，对比NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法、AlCl3比色法、直接测定法对碱韭总黄酮含量测定的影响。然后对AlCl3比色法测定条件（显色时间、AlCl3加入量、显色温度、pH值和乙醇的浓度）进行了优化。结果：选用AlCl3比色法测定的结果准确可靠，采用优化后的AlCl3比色法测定条件测得碱韭总黄酮主要存在于叶和花中，平均含量为（38.60±5.79）mg·g-1。结论：碱韭具有较高的黄酮应用价值，可作为食品黄酮类添加剂和营养保健食品开发利用。

关键词：碱韭；AlCl3比色法；总黄酮

Optimization of Determination Method of Total Flavonoids Content in Allium polyrhizum Turcz. ex Regel

GAO Xuefeng1， GAO Jian1， YANG Yuping1， MEN Zhonghua1， DONG Guicheng2， ZHAO Peng1*

（1.School of Biological Science and Technology， Baotou Teachers College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014030， China; 2.College of Life Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010011， China）

Abstract： Objective： To screen test methods suitable for determining the total flavonoid content of Allium polyrhizum Turcz. ex Regel， and to analyze and evaluate the total flavonoid content of Allium polyrhizum Turcz. ex Regel in different collection years and parts. Method： Using rutin as the reference material and Allium polyrhizum Turcz. ex Regel leaves as the experimental material， the effects of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric method， AlCl3 colorimetric method， and direct determination method on the determination of total flavonoid content in Allium polyrhizum Turcz. ex Regel were compared. Then， the determination conditions of the AlCl3 colorimetric method （color development time， AlCl3 addition amount， color development temperature， pH value， and ethanol concentration） were optimized. Result： The results obtained by using AlCl3 colorimetric method were accurate and reliable. The optimized AlCl3 colorimetric method was used to determine the conditions under which the total flavonoids of alkali leeks mainly exist in leaves and flowers， with an average content of （38.60±5.79）mg·g-1. Conclusion： Allium polyrhizum Turcz. ex Regel has high flavonoid application value and can be used as a food flavonoid additive and nutritional health food development and utilization.

Keywords： Allium polyrhizum Turcz. ex Regel; AlCl3 colorimetric method; total flavonoids

碱韭（Allium polyrhizum Turcz. ex Regel）是百合科（Liliaceae）葱属（Allium）多年生草本植物，广泛分布于内蒙古呼伦贝尔、锡林浩特、乌兰察布等地[1]。碱韭花又被称为扎蒙花，是西北地区日常生活中的一种烹调炝油提味的绿色食品，同时也是畜牧业季节性饲草和秋季抓膘的常用野生植物，全草及其种子可以入药，有解毒、化瘀、消炎消肿、健胃、利尿等功效，是一种可食用的多功能天然植物[2]。碱韭中重要活性成分为黄酮类物质[3-4]，为加快碱韭黄酮的开发利用，有必要对碱韭黄酮的含量进行快速有效的监测。由于碱韭中黄酮类物质种类丰富，含量不一，以分光光度法测定总黄酮含量科学准确、操作简便、易于工业推广，可大大降低检测成本[5]。本文分析了直接测定法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法、AlCl3比色法对碱韭总黄酮含量测定的适用性，筛选出最适合的测定方法，对方法的精密度、稳定性等进行研究，并对不同采集年份不同部位碱韭总黄酮进行分析评价，以期为碱韭资源有效保护提供参考，同时为开发具有黄酮类食品添加剂的保健食品提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以2019年、2020年、2021年8月分别采自内蒙古自治区鄂尔多斯市达拉特旗的碱韭为实验材料，采后将根、叶、花清洁并分离，室内自然阴干，经粉碎后过60目筛，密封低温冷藏备用。考虑碱韭叶便于收集和处理，因此本文优选试验部分以

2019年8月采集的碱韭叶为研究对象。

1.2 仪器和试剂

N4S紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；S22T数控超声波清洗器（上海仪天科学仪器有限公司）；TB-114电子分析天平（河南信陵仪器设备有限公司）；H/T16MM台式高速离心机（南北仪器有限公司）；QE-200高速多功能粉碎机（上海沪粤明科学仪器有限公司）。

芦丁标准品（纯度≥98%，西安汇林生物科技有限公司）；无水乙醇（济南世纪通达化工有限公司）；甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、冰乙酸、氢氧化钠、三氯化铝、无水乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为二次蒸馏水。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液制备

（1）碱韭总黄酮提取液的制备。准确称取

1.0 g碱韭叶粉末，分别选取水、乙酸乙酯、60%乙醇和60%甲醇作为提取溶剂，控制料液比为

1∶30（g∶mL），超声功率为400 W，在60 ℃下超声提取60 min。提取液经过滤分离后，收集至棕色瓶中，冷藏备用。

（2）芦丁标准液的制备。精密称取40 mg于

120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品，用60%乙醇溶解定容至200 mL，配制成浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。

1.3.2 碱韭总黄酮含量测定方法的选择

黄酮类化合物一般与水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等溶剂具有较好的亲和性，为了客观反映碱韭总黄酮在各提取溶剂中的存在状态，体现与芦丁标准品的可参比性和测定方法的一致性，本试验在各提取溶剂下进行显色反映，优选碱韭总黄酮测定方法。同时确定碱韭总黄酮的最佳提取溶剂。所有实验均重复3次。

（1）直接测定法。分别移取水、乙酸乙酯、60%乙醇和60%甲醇各1 mL，以及芦丁标准液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，使用各提取溶剂定容至10 mL，摇匀并室温下静置15 min，分别以各提取溶剂为空白对照，在200～700 nm波长下进行光谱扫描。

（2）NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法。分别移取各提取溶剂1 mL和芦丁标准液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，逐一加5% NaNO2溶液0.3 mL、10% Al（NO3）3溶液0.3 mL、4% NaOH溶液4 mL，每种试剂加入后均需摇匀并室温下放置6 min，然后使用各提取溶剂定容至10 mL，摇匀，室温静置15 min，分别以各提取溶剂为空白对照，在400～600 nm波长下进行光谱扫描[6]。

（3）AlCl3比色法。分别移取各提取溶剂1 mL和芦丁标准液1 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3，使用各提取溶剂定容至10 mL，摇匀，室温静置30 min，分别以各提取溶剂为空白对照，在200～700 nm波长下进行光谱扫描[7]。

1.3.3 AlCl3比色法测定条件的优化

（1）缓冲溶液pH及测定波长的选择。准确吸取1 mL芦丁标准液和1 mL 60%乙醇的样品提取液，置于10 mL具塞刻度试管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3再分别加入pH值为3.6、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.8和6.2的NaAC-HAC缓冲液2 mL，使用60%乙醇定容至10 mL，摇匀后，室温静置30 min，分别以1 mL蒸馏水代替芦丁标准液（样品提取液）为空白对照，在200～500 nm波长下进行光谱扫描。

（2）显色剂AlCl3用量的选择。准确吸取1 mL芦丁标准液和1 mL 60%乙醇的样品提取液，置于

10 mL具塞刻度试管中，分别加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.5 mL和2.0 mL，再加入pH值为

4.4的NaAC-HAC缓冲液2 mL，用60%乙醇定容至10 mL，摇匀后，室温静置30 min，分别以1 mL蒸馏水代替芦丁标准液（样品提取液）为空白对照，在405 nm下测定吸光度值。

（3）显色时间和显色温度的选择。准确吸取1 mL芦丁标准液和1 mL 60%乙醇的样品提取液，置于

10 mL具塞刻度试管中，分别加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值为4.4的NaAc-HAc缓冲液2 mL，用60%乙醇定容至10 mL，分别以1 mL蒸馏水代替芦丁标准液（样品提取液）为空白对照。在显色5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min和60 min后于405 nm下测定吸光度值。在确定显色时间后，控制显色温度为10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃，测定吸光度值。

（4）显色溶剂浓度的选择。准确吸取1 mL芦丁标准液和1 mL 60%乙醇的样品提取液，置于

10 mL具塞刻度试管中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值为4.4的NaAC-HAC缓冲液2 mL，分别用0%（蒸馏水）、10%、30%、50%、60%、70%、95%乙醇定容至10 mL，以1 mL蒸馏水代替芦丁标准液（样品提取液）为空白对照。摇匀后，按（3）中确定的显色时间和显色温度（室温）静置25 min后，每隔20 min在405 nm波长下测定吸光度值，直至65 min。所有实验均重复3次。