酶联免疫吸附测定法检测淡水鱼中孔雀石绿残留

摘 要：目的：了解武汉市常青花园小区在售淡水鱼产品的孔雀石绿污染情况。方法：利用酶联免疫吸附测定法对常青花园周边地区的3个菜市场和3个超市所售卖的常见淡水鱼进行检测。结果：共检测组织样本39份，其中检测出孔雀石绿的样本有21份，孔雀石绿检出率为53.8%;超出国家标准的样本有13份，不合格率为33.3%。结论：该区域在售淡水鱼中孔雀石绿的残留情况比较突出。由于试验样本的来源难以进一步追溯，确定孔雀石绿违规添加的环节难度较大，亟需市场监管部门对市售淡水鱼产品从养殖、运输到售卖全链条建立起清晰可查的溯源体系，以便更好地保障市民的食品安全。

关键词：酶联免疫吸附测定法;孔雀石绿;淡水鱼

Abstract： Objective： To understand the malachite green pollution of freshwater fish products sold in Changqing Garden community， Wuhan. Methods： The enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect malachite green residues in common freshwater fish sold in three markets and three supermarkets in surrounding area. Results： Malachite green residues were detected from a total of 21 items in 39 commercially available freshwater fishes， with the detection rate was 53.8%， and 13 items exceeded the national standard， with a positive detection rate of 33.3%. Conclusions： It shows that the residue of malachite green in freshwater fish sold in this area is more prominent. As the source of the experimental samples is difficult to trace further， it is difficult to determine the illegal addition of malachite green. Therefore， it is necessary for the market supervision department to establish a clear and traceable traceability system for the whole chain of freshwater fish products sold on the market from breeding， transportation to sale， so as to better guarantee the food safety of citizens.

Keywords： enzyme-linked immunosorbent assay; malachite green; freshwater fish

孔雀石绿（Malachite Green，MG），外观呈绿色，为有金属光泽的结晶体。孔雀石绿主要是以苯甲醛和N，N-二甲基苯胺作为底物经过一系列化学反应而制得，易溶于水，对治疗水产品疾病有较好的作用[1]。孔雀石绿用作渔药可有效防治水产养殖中常见的病害，如水霉病、小瓜虫病等[2]，对细菌、虫等病害也能够进行有效控制[3]。但是，大量研究显示孔雀石绿在养殖动物体内代谢缓慢，残留时间长，并且孔雀石绿及其代谢物会致畸、致癌、致突变[4-5]。

2002年，孔雀石绿被列入我国《食品动物禁用的兽药以及其他化合物清单》，规定在食用动物饲养过程中不得添加孔雀石绿。同时，在《无公害食品 水产品中渔药残留限量》中明确规定水产品中不得检出孔雀石绿，但因孔雀石绿价格低廉、使用简单，抗菌效果好、对其毒副作用宣传力度不够，部分养殖户仍然违规将其用于水产养殖[6]。

目前，检测孔雀石绿残留的方法主要有高效液相色谱法[7]、光谱法[8]、电化学法[9]、免疫学测定法[10]。其中，酶联免疫法是一种抗原特异性检测方法，样本或标准品中的孔雀石绿和HRP标记的孔雀石绿竞争结合微孔板中抗孔雀石绿单克隆抗体，洗涤后显色，样本吸光度值与其所含孔雀石绿量成负相关。该方法不仅能快速、灵敏地检测水产品中的孔雀石绿残留，还具有低成本、检测结果准确可靠等优点[11]。

本研究选择武汉轻工大学附近的常青花园小区作为检测点，检测大型社区在售水产品的食品安全。常青花园地处武汉市北三环，临地铁2号线和6号线，交通便利，周围无大型工厂，常住人口20万左右，对水产品需求量大。对常青花园小区的水产品市场前期调查发现，该地区常青菜场、美联菜场、石桥菜场和A超市、B超市、C超市的水产区多售卖鲫鱼、草鱼、鳊鱼、鲤鱼、财鱼和鲈鱼等淡水鱼类。考虑到孔雀石绿在鲫鱼体内代谢缓慢，无法完全代谢[12]，而鳊鱼、鲈鱼在养殖时易患水霉病[13-14]，且这3种鱼也在各市场所有摊位均有售卖，因此本试验中优先对鲫鱼、鳊鱼及鲈鱼进行检测，其他鱼类结合实际情况进行抽样调查。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒（上海臻科生物），检测方法见说明书;氯化钠（国药集团）;正己烷（国药集团）;乙腈（国药集团）。

1.2 仪器与设备

多功能酶标仪（德国PerkinElmer，EnSpire 2300）;浓缩仪（常州阿米勒，YPNSY-12）、离心机（长沙湘仪，H1850R）;匀浆机（新宝仪器厂，FSH-2A）;电子天平（上海天美YP1002N，感量0.01 g）。

1.3 购买鱼类的主要场所及种类

本试验主要检测了常青花园地区3个菜市场和3个大型超市。3个菜市场里主营淡水养殖鱼类的共有7家（同一个菜场不同的摊位用A、B、C来表示），从其中购买的鱼类品种如表1所示。

1.4 试验方法

1.4.1 试剂准备

25%氯化钠溶液、将试剂盒中提供的2×浓缩复溶液、20×浓缩洗涤液稀释至1×，所有试剂在使用前平衡至室温。

1.4.2 样品的制备与提取

（1）组织样品的处理。除去非食用部分，剪碎鱼肉后，用匀浆机充分磨碎样品;取4 g样品于50 mL离心管中，加入2 mL的25%氯化钠溶液，振荡2 min;依次加入100 μL提取剂1，4 mL乙腈，2 mL正己烷，充分振荡;4 000 r/min离心5 min，取中层清澈液体2～5 mL，加入50 μL氧化剂，轻轻振荡混合30 s;在65 ℃下空气流吹干，加入1 mL复溶液溶解干燥残留物，振荡1 min，取50 μL检测。按说明书要求每组做2个平行。

（2）水样品处理。取50 μL市场收集的水样与450 μL已稀释好的复溶液充分混合30 s，取50 μL进行分析检测。每组2个平行。

1.4.3 酶联吸附和显色

在试验开始前，将微量测试孔提前从4 ℃冰箱中取出，室温平衡30 min。在微孔中加50 μL待测样品，然后加入50 μL抗体工作液，充分混匀后用盖板膜将微孔板封闭，轻敲微孔板边缘振荡混匀。在室温环境下，反应30 min。

反应结束后，将抗体和样品的混合液倒出并甩干孔板，取250 μL洗涤液加在待测微孔中，洗板4～5次，洗板间隔15～30 s。洗板结束后，取100 μL酶标记物加入待测微孔中，轻敲微孔板，混合均匀，用盖板膜盖板后将酶标板室温孵育30 min，重复洗板步骤。待微孔板干燥后，取50 μL底物A溶液、50 μL底物B溶液加在待测微孔中，轻轻摇匀，将微孔板置于暗处充分显色15 min，最后取50 μL终止液迅速加到微孔中终止反应。

1.4.4 计算公式

式中：B为各标准品或样本溶液吸光度均值;B0为标准液吸光度均值。

1.4.5 分析检测

使用酶标仪在450 nm处进行检测，数据采集在5 min内完成。

1.4.6 数据处理

在450 nm波长下，测定标准品3次。以按式（1）计算出各浓度标准品的百分吸光率作为纵坐标，以各标准品浓度的对数形式作为横坐标，用CurveExpert（1.4）绘制出标准曲线图。酶标仪读取样品2次，取平均值，以标准曲线求得孔雀石绿残留量。

2 结果与分析

2.1 各市场鱼类来源

通过市场调查发现大型超市均有自己的供应商，而菜场零售摊贩基本是从四季美农贸城采购再行售卖，不同市场的进货来源如表2所示。受客观因素影响，2020年后距离常青花园最近的华南海鲜批发市场停业，四季美农贸城成为距离常青花园地区最近的农产品批发市场（约15 km），因此几乎所有的零售摊贩都选择去四季美农贸城进货，仅有极少数摊贩选择去距离常青花园地区约27 km的白沙洲农副产品批发市场进行采购。

2.2 标准曲线

孔雀石绿的标准曲线以各浓度标准品的百分吸光度值为纵坐标，各标准品浓度转换成对数为横坐标，得到标准曲线，如图1所示，相关系数为0.986。

2.3 孔雀石绿残留含量测定

本次试验采用上海臻科生物技术有限公司的试剂盒，针对常青花园市场水产品进行集中收集分析，根据试剂厂家给出的样品分析程序，对得到的吸光度值进行分析，得到孔雀石绿的残留量，如表3所示。结合《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》，孔雀石绿在水产品中的检出限为0.5 μg/kg，即国家规定每克水产品中孔雀石绿的检出量不得超过0.5 ng/g。

由表3可知，在检测的39份组织样本中，检出（试剂盒检出限为0.1 ng/g）孔雀石绿的样品为21个，占全部样本的53.8%，其中超出国家规定检出量的不合格样本有13个，占全部样本的33.3%。不合格样本分别是常青花园菜场A家鲫鱼、鲈鱼、财鱼，常青花园菜场B家鲈鱼、鲫鱼;石桥菜场A家草鱼、鳊鱼，石桥菜场C家鲈鱼;美联菜场A家鲈鱼、鳊鱼;C超市鳊鱼;B超市鳊鱼;A鲢鱼。在优先检测的鲫鱼、鳊鱼和鲈鱼中，鲫鱼的不合格率相对较低，为20%，鳊鱼和鲈鱼的不合格率是40%，说明在易患水霉病等疾病的鱼类中违规添加孔雀石绿的情况更加严重;结合抽查的草鱼（16.7%）和财鱼（50%）的不合格率检出结果，基本符合单价越高的淡水鱼中孔雀石绿残留几率越高的规律，在2011—2013年对武汉市市售水产品污染检测的结果也基本符合这个规律[15]。可能是因为售价高的鱼类染病或死亡，会带来更大的损失，因此养殖户、中间商或商家为了延长鱼的存活时间，在养殖、运输或存放期间，可能违规添加孔雀石绿。

尽管3个菜场进货的批发市场相同，但批发市场是不同货源集散地，同种鱼类的养殖、运输情况都可能不一样，检出的孔雀石绿情况没有很强的规律性也证明了这一点。3个超市都有自己的供货商，可以看出来源于不同供货商的鱼检出情况也不相同。为了确认是哪个环节存在违规添加孔雀石绿的情况，笔者还抽查了购买样品时带回的水样，发现在常青花园A家摊位取回的水样中，孔雀石绿的浓度高达49.6 ng/g，该家售卖的5种鱼中，有3种鱼孔雀石绿残留超标，说明该店很有可能在销售过程中违规添加了孔雀石绿。其他检测水样中未检出孔雀石绿，但仍然有部分鱼类组织中有检出或超标检出孔雀石绿的情况，这可能是鱼类在养殖或运输中暴露在有孔雀石绿的环境中。