动物源性食品中16种β-受体激动剂高灵敏检测与膳食暴露评估

摘 要：为有效开展食品安全风险评估，对β-受体激动剂（瘦肉精）进行有效监管，本研究以超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）联用法建立了动物源性食品中16种痕量β-受体激动剂的检测方法。经酶解、提取、固相萃取净化，采用多反应监测（MRM）同时捕集16种目标分子母离子-子离子离子对，7.5 min内实现高效、准确分离测定。16种目标物加标回收率为64.5%～112.3%，日间精密度0.62%～1.37%，保留时间偏差为0.010～0.042，检出限为0.05～0.84 µg/kg，定量限为0.17～2.76 µg/kg。应用本方法完成261批动物源性食品的安全风险监测，实现快速准确的批量筛选，发现21批样品中残留11种β-受体激动剂。依据风险监测研究结果对β-受体激动剂进行膳食暴露评估，发现当同一动物组织中同时含有多种受体激动剂，总含量超过1.08 µg/kg时将增加健康风险。

关键词：β-受体激动剂;痕量检测;膳食暴露评估;莱克多巴胺

Abstract： In order to effectively carry out food safety risk assessment and effectively supervise for the β-agonists， a method for the detection of 16 trace β-agonists in animal-derived food was established by ultra-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. After enzymatic hydrolysis， extraction， and solid-phase extraction purification， 16 target molecular precursor ion-product ion ion pairs were simultaneously captured by multiple reaction monitoring （MRM）， and accurate separation and determination were achieved within 7.5 minutes. The recovery rates of 16 target compounds were 64.5%～112.3%， the inter-day precision was 0.62%～1.37%， the retention time deviation was 0.010～0.042， the detection limit was 0.05-0.84 µg/kg， and the quantification limit was 0.17～2.76 µg/kg. Using this method， the safety risk monitoring of 261 batches of animal-derived food was completed. Fast and accurate batch screening was achieved， and 11 β-receptor agonists were found in 21 batches of samples. Dietary exposure to beta-agonists was assessed based on the results of risk surveillance studies. Increased health risk was found when multiple receptor agonists were present in the same animal tissue at a total level of more than 1.08 µg/kg.

Keywords： β-receptor agonist; trace detection; dietary exposure assessment; ractopamine

“瘦肉精”是指肾上腺素受体激动剂类（β-兴奋剂），主要包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。β-兴奋剂类既不是兽药，也不是饲料添加剂，其可有效促进动物的肌肉生长，提高动物酮体的瘦肉率并使其增重。β-兴奋剂易蓄积在动物体内，食用含有残留肾上腺素受体激动剂的动物源性食品会造成人体的急性或慢性中毒，严重者会有生命危险，威胁生命安全。从对食品安全的管控和消费者健康角度出发，国内禁止使用“瘦肉精”类药物用于食品动物的饲养生产过程，但在动物饲养过程中“瘦肉精”仍屡禁不止[1-4]，2021年3月15日，央视“3·15”晚会再次曝光了“瘦肉精羊”事件。

对于β-受体激动剂的分析技术，国内外相关研究通常采用液相色谱-质谱联用法[5-6]、气相色谱-质谱联用法[7]、毛细管电色谱耦合质谱法[8]、高效液相色谱法[9]、免疫分析法[10]、毛细管电泳法[11]、电化学传感器方法[12-13]和表面增强拉曼光谱法[14]等。由于液相色谱-串联质谱法准确度高、无假阳性、检出限低、重现性好和无需衍生等特点，β-受体激动剂类药物残留检测国家标准主要采用液相色谱-质谱联用法。然而，由于肾上腺素受体激动剂品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，残留水平一般较低和烦琐冗长的样品前处理过程一直干扰着检测结果的准确性，因此需要更高效灵敏的前处理技术和检测技术实现对其准确快速的测定。本研究利用固相萃取处理与超高效液相色谱-串联质谱技术，实现对16种β-受体激动剂的准确、快速、定量检测分析，并开展受体激动剂膳食暴露研究。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

仪器：超高效液相色谱-串联质谱联用仪（Q TRAP 5500 AB Sciex Instruments）;均质器（SilentCrusher M，德国海道夫公司）;涡旋混合器（VORTEX 3，德国IKA）;超速离心机（Sorvall LYNX6000，Thermo Scientific）;氮吹仪（N-EVAP-45，Organomation）;恒温摇床（MaxQ 420 HP，Thermo Scientific）;正压固相萃取仪（SPE，J2 Scientific）;超声波清洗器（Elmasonic P120H，Elma）;超纯水系统（Thermo Scientific）;-40 ℃冰箱（HYCD-282，青岛海尔）;电子天平（XSE 105DU，梅特勒托利多）。

标准样品：沙丁胺醇（99.9%）、特布他林（99.0%）、盐酸克伦特罗（99.0%）、盐酸莱克多巴胺（96.1%）、西马特罗（99.9%）、盐酸多巴胺（99.0%）、马布特罗盐酸盐（>98.0%）、氯丙那林（99.6%）、非诺特罗（99.0%）、马喷特罗盐酸盐（>98.0%）和酒石酸福莫特罗（98.2%），上述11种标准样品均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;盐酸溴布特罗（99.0%）和苯乙醇胺A（99.0%）购自天津阿尔塔科技有限公司，盐酸妥布特罗（99.0%）和苯氧丙酚胺盐酸盐（98.0%）购自Bepure公司，盐酸齐帕特罗（98%）购自南京生利德生物科技有限公司。

试剂：β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶（10 000 units/mg，MERCK）;甲酸、甲醇、乙腈（MERCK色谱纯试剂），其他试剂均为分析纯;固相萃取柱：MCX强阳离子交换SPE柱（60 mg，3 mL，Waters）。

1.2 试验方法

1.2.1 β-受体激动剂标准溶液配制

准确称取适量沙丁胺醇、特布他林、盐酸克伦特罗、盐酸莱克多巴胺、西马特罗、盐酸多巴胺、马布特罗盐酸盐、氯丙那林、非诺特罗、马喷特罗盐酸盐、酒石酸福莫特罗、盐酸溴布特罗、苯乙醇胺A、盐酸妥布特罗、苯氧丙酚胺盐酸盐和盐酸齐帕特罗标准品，用甲醇溶解并分别配制成100 µg/mL的单一物质β-受体激动剂储备液，避光保存于-18 ℃冰箱内，有效期12个月。准确移取0.5 mL上述16种单一物质标准储备液至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成1.0 µg/mL 16种β-受体激动剂混合标准储备液。工作液现用现配，使用前用流动相（0.1%甲酸-乙腈，96∶4，V/V）由混标储备液逐级稀释，配制成浓度范围为1.42～276 µg/kg的混合标准工作液。

1.2.2 仪器分析

（1）色谱条件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）;柱温：40 ℃;样品室温度：4 ℃;进样体积：5.0 µL;流动相A：0.1%（V/V）甲酸水溶液;流动相B：乙腈;流速：0.30 mL/min;梯度洗脱条件：0.00～2.00 min，4% B;2.00～10.0 min，4%～65% B;10.00～10.11 min，65%～4% B。

（2）质谱条件。离子化方式：电喷雾（ESI）离子源;正离子多反应监测（MRM）扫描;气帘气：35 psi;碰撞气：Medium;喷雾电压：5 500 V;雾化温度：550 ℃;雾化气：55 psi;辅助加热气：50 psi。试验所用脱溶剂气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

1.2.3 样品制备

称取2 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入8 mL乙酸钠溶液，再加50 µL β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，充分混匀，37 ℃水浴水解12 h。水解完成后高速冷冻离心10 min，转数22 000 r/min，冷冻离心温度-10 ℃。离心完毕，取出离心管去除油脂层，将上清液全部转移至洁净离心管中，再次高速冷冻离心去除油脂层。最后，准确移取4 mL上清液转移至50 mL离心管中，加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液充分提取;提取完成后7 000 r/min离心10 min，转移全部有机相，40 ℃水浴下氮气吹干，加入5 mL乙酸钠缓冲液，超声至充分溶解，待净化。

MCX固相萃取柱先用3 mL甲醇和3 mL水活化，将上述残渣溶液全部过柱，然后依次用3 mL水、3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗，氮气加压抽干。用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱。收集洗脱液，在40 ℃水浴下氮气吹干，残余物用流动相1.0 mL溶解后，涡旋混匀，过0.22 µm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 16种β-受体激动剂检测质谱参数的确定

利用针泵进样将16种β-受体激动剂的混合标准溶液注入质谱仪中优化质谱参数。目标物进入电喷雾离子源后，均能够形成稳定的加合离子，以ESI正离子模式对激动剂药物进行母离子确认及子离子全扫描。本方法根据待测目标物的保留时间，采用分段扫描的方式对不同药物的特征离子进行数据采集，以提高灵敏度。16种β-受体激动剂的保留时间及定性、定量离子、去簇电压和碰撞能量等质谱条件见表1。

2.2 方法学验证

移取1.0 µg/mL的β-受体激动剂混合标准储备液，用流动相（乙腈-0.1%甲酸水溶液，4∶96，V/V）配制成系列浓度的混合标准溶液，以各组分的浓度与其定量离子峰面积进行线性回归。由表2可知，各受体激动在1.42～276 µg/kg浓度范围内呈良好的线性关系（R>0.991），检出限为0.05～0.84 µg/kg、定量限为0.17～2.76 µg/kg。