酶催化橡胶籽油基富含亚麻酸的OPL型结构酯

摘 要：本文对无溶剂体系中的1-油酸-2-棕榈酸-3-亚麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）型结构酯的转酯化合成工艺进行了研究及优化，对以三棕榈酸甘油三酯（Tripalmintin，PPP）为原料制备OPL结构酯的方式进行了实验室探究。结果表明，OPL的最佳合成工艺为PPP与橡胶籽油脂肪酸按摩尔比为1∶7混合，PPP的质量为Novozym®的10.0%，以40086脂肪酶为催化剂，在55 ℃和200 r/min的摇台下反应12 h。在此最优条件下，OPL的产率达到了42.35%。

关键词：人乳脂替代品;OPL结构酯;转酯化反应

Enzyme Catalyzed Rubber Seed Oil-based OPL-Type Structural Ester Rich in Linolenic Acid

YAO Shuyi， MAN Jiani， HUANG Shucheng

（Beijing University of Chemical Technology， Beijing 102200， China）

Abstract： This paper studies and optimizes the transesterification synthesis process of 1-oleic acid-2-palmitate-3-linolate type 1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol （OPL） in a solvent-free system. The production method of OPL structural ester produced from Tripalmintin （PPP） was explored. The results show that the optimal synthesis process of OPL is as follows： PPP is mixed with rubber seed oil fatty acids at a molar ratio of 1：7， with PPP mass 10.0% Novozym® 40086 lipase as catalyst and reacted in 55℃， 200 r/min shaker for 12 h. Under this optimal condition， the yield of OPL reached 42.35%.

Keywords： human milk fat substitute; OPL structural ester; transesterification reaction

母乳中富含抗体，可以促进婴儿免疫系统的发育，其中乳脂肪能够为婴幼儿提供大量易于消化吸收的营养成分以及能量，这是传统的动物脂肪（如牛羊肉乳脂）和植物脂肪（如棕榈油和胡麻油等）无法提供的。在胰脂肪酶的催化下，动植物脂肪酸与钙离子结合生成不易消化的饱和脂肪酸钙，使硬度上升，营养损失，益生菌的生长繁殖被抑制，造成便秘。但由于个人、社会等多方面的影响，导致我国的母乳喂养率较低，市场对婴幼儿配方乳粉的需求量极大[1]。通过对母乳的分析发现，母乳脂肪的脂肪酸有大量脂肪以1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO）的结构存在。OPO型结构酯在消化时不会产生难以消化吸收的饱和脂肪酸钙，有利于婴幼儿吸收营养。因此，OPO结构酯是目前国内外市面上常见的高端婴幼儿奶粉的营养添加剂成分之一。但是，由于中国母体膳食结构原因，母乳中亚油酸含量较高，且导致亚油酸/亚麻酸较高，高于推荐值。现有母乳脂肪替代品（OPO）的不饱和脂肪酸组成和中国母乳的不饱和脂肪酸组成存在一定差异，因此需要开发一种更适合中国婴幼儿食用的奶粉营养强化剂。笔者认为1-油酸-2-棕榈酸-3-亚麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）更适合作为中国婴幼儿食用奶粉的营养强化剂，以代替OPO型结构酯。对比了解多种动植物原料中的成分后，发现橡胶籽油较为适合作为OPL型结构酯的合成原料[2]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

硫酸，98% AR;碳酸氢钠，AR;氢氧化钾，AR;乙醇，95% CP;Novozym®435，1 000 PLU/g，Novozymes;Novozym® 40086，275 IUN/g，Novozymes;Lipozym TL IM，250 IUN/g，Novozymes;Candida sp.99-125，38 KLU/g;正己烷，AR;无水硫酸钠，AR;氯化钠，AR。

1.2 实验方法

1.2.1 测定酶类型对酯转换过程的影响

产酶菌株和固定化方法不同，脂肪酶活性、底物选择和最佳反应条件存在很大差异，因此选择合适的脂肪酶在酯转换化制备OPL过程中非常重要。选择Novozym®435，Lipozyme TL IM，Novozym® 40086和Candida sp.99-125作为转酯化酶，分别研究了不同类型的脂肪酶对转酯化反应的影响。以PPP∶橡胶籽油脂肪酸=1∶7为底物，添加PPP质量10%的脂肪酶，在55 ℃，200 r/min的条件下，在摇床设备上催化反应24 h。通过测量甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）的含量来比较转化速度的快慢。

1.2.2 温度对脂肪酶活性有决定性的影响

一般情况下，当温度适当升高时，酶催化反应的活性会增加，但温度过高会导致酶蛋白的不可逆变性和生物活性的丧失。因此，研究实验过程中的最适温度也是研究的热点之一。以45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃为温度变量，在Novozym® 40086的基础上，振荡反应24 h，每4 h用气相色谱法测定一次样品中各组分的表征[4]。

1.2.3 脂肪酶添加量对水解反应的影响

在反应过程中，脂肪酶先通过活性位点与底物结合形成中间复合物。当脂肪酶的用量达到一定浓度时，其对反应的积极作用逐渐减弱[5]。同时，过多的脂肪酶会增加生产成本。因此，不同脂肪酶对转酯化程度的影响也是生产过程中考量的重要因素之一。本实验在前期实验条件的基础上，继续研究同种催化脂肪酶Novozym® 40086在不同的用量条件下（3%、5%、10%和15%）对转酯生产OPL结构酯的影响。

1.3 油脂酸价的测定

PPP样品油的酸值按GB 5009.229—2016[3]进行测定。取少量油样，准确称量，加入20 mL中性乙醇醚（1∶1）溶液，用超声波机溶解样品，加入2滴酚酞，得到待测溶液。用预先校准的氢氧化钾乙醇溶液滴定，浓度约为0.1 mol/L，当溶液开始出现粉红色停止滴定，按下式计算油的酸值：

式中：Av为样品酸价，mg/g;56.11为KOH的摩尔质量，单位mg/mmol;C为氢氧化钾-乙醇溶液浓度，mol/L;V为氢氧化钾-乙醇溶液消耗体积，mL;m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 测定酶类型对酯转换过程的影响分析

由图1知，各脂肪酶的初始产率均较高，但随着反应过程的进行，脂肪酶的催化效率逐渐降低，12 h后反应体系中不同TAG的含量趋于平衡。Lipozyme® TL IM和Novozym® 40086的催化反应率和OPL产率（36.300%和37.540%）均高于Candida sp.99-125与Novozym® 435脂肪酶（30.585%和34.545%）。然而，如表1所示，使用Lipozyme TL IM的体系中，总甘油酯（Glycerin Ester，GLE）的比例远低于使用Novozym® 40086的体系中TAG的比例。这意味着使用Novozym® 40086的体系中TAG的水解量远远低于Lipozyme® TL IM，因此本实验选用Novozym® 40086作为催化脂肪酶。

2.2 温度对水解反应的影响

由图2可知，反应在初始阶段，反应速率随着温度的升高而快速上升。在55 ℃环境下，反应平衡时（即反应12 h后）产量为39.31%，而在60 ℃下，平衡时仅为35.62%，可推断出脂肪酶在过高的温度下发生了部分失活。虽然产量仍然比45 ℃、20 ℃高，但是综合考虑生产成本条件和酶的可持续使用特点，得出在55 ℃时条件最适宜。

2.3 脂肪酶添加量对水解反应的影响

由图3可知，不考虑脂肪酶Novozym® 40086用量比为3%时的反应测定，不同脂肪酶添加量下的催化效果在12 h后达到平衡。

在水平对比剂量下，反应速率随脂肪酶用量的增加而增加，平衡时反应产率也呈正增加。但当脂肪酶含量从PPP的10%增加到15%时，反应速率没有显著增加，最终产物中OPL的产率为43.17%，与10%的产率（42.35%）相近。因此，综合考虑OPL产量和生产成本，选择10%的PPP酶剂量是最合适的。

3 结论

本文从橡胶籽中提取出OPL结构酯运用到高端的乳粉中，研究了不同酶、不同温度下、不同反应途径下，如何高效地提取出OPL结构酯。实验结果表明，富含亚麻酸、亚油酸的橡胶籽油脂肪酸作为原料可以高效产出OPL结构酯，并有效防止Sn-2棕榈酸的转移。以橡胶籽油中的脂肪酸为基础，研究了转酯化制备OPL结构酯的生产过程，PPP∶橡胶籽油=1∶7（摩尔比），加入10 wt%（以PPP质量计）的Novozym® 40086脂肪酶，脱水处理，在55 ℃下，200 r/min反应12 h，可以实现OPL产率为42.35%。 符合国家的标准，使生产技术日后用于大量生产OPL结构酯成为可能。

参考文献

[1]赵富建.某地区6个月内婴儿纯母乳喂养现状及相关因素[J].临床医学研究与实践，2018，3（9）：105-106.

[2]Srivastava A，Akoh C C，Chang S W，et al.Candida rugosar lipase LIP1-catalyzed transesterification to produce human milk fat substitute[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（14）：5175-5181.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中酸价的测定：GB 5009.229—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.

[4]Zhang X， Nie K L， Zheng Y L，et al.Lipase Candida sp. 99-125Coupled with β-cyclodextrin as additive synthesized the human milk fat substitutes[J].Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2016，125：1-5.

[5]Wei W， Feng Y F， Zhang X，et al.Synthesis of structured lipid 1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol in both solvent and solvent-free system[J].LWT - Food Science and Technology，2015，60（2 ）：1187-1194.