高效液相色谱法测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素以及香豆素的研究

摘 要：本文参照《食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》（GB 5009.284—2021）对液相色谱法测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测方法进行研究。实验结果表明，在0.2～25.0 μg/mL，香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的峰面积均与浓度线性关系良好，相关系数>0.999 9，加标回收率为96.1%～108.7%，RSD为1.27%～3.00%，可满足食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的检验要求。同时，对市售的多款食品进行4种食用香料的检测，部分检出香兰素与乙基香兰素，都在合格范围内。

关键词：香兰素;甲基香兰素;乙基香兰素;香豆素;高效液相色谱法

Determination of Vanillin， Methyl Vanillin， Ethyl Vanillin and Coumarin in Food by HPLC

GUAN Shuxia， LIN Xinchuan， DU Ying

（Institute of Food and Drug Inspection and Testing， Weihai 264400， China）

Abstract： In this paper， according to GB 5009.284—2021， the determination method of vanillin， methyl vanillin， ethyl vanillin and coumarin in food by liquid chromatography is studied. The experimental results show that the detection range is 0.2～25.0 μ g/mL， the peak areas of vanillin， methyl vanillin， ethyl vanillin and coumarin have a good linear relationship with the concentration， the correlation coefficient is> 0.999 9， the spiked recovery is 96.1%～108.7%， and the RSD is 1.27%～3.00%， which can meet the inspection requirements of vanillin， methyl vanillin， ethyl vanillin and coumarin in food. At the same time， four kinds of edible spices were tested for many kinds of food sold in the market. Some vanillin and ethyl vanillin were detected， which were within the qualified range.

Keywords： vanillin; methyl vanillin; ethyl vanillin; coumarin; high performance liquid chromatography

香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素都具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，其中乙基香兰素香气更是香兰素的3～4倍，且留香持久[1]。这几种香料用途广泛，主要起增香和定香作用，广泛用于食品、日用化妆品、烟草等行业[2]。香豆素一般存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰和兰花中，具有新鲜干草香和香豆香，但一般不作食用，允许烟用和外用。据欧盟专家委员会2000年2月24日报道，人体大量摄入香兰素等食品添加剂可导致头痛、恶心、呕吐和呼吸困难等症状，严重的可能会损伤肝、肾[3]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中允许使用的食品用合成香料名单有1 477种，其中包括香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素，食品分类中约有28种食品没有加香的必要，不得添加食品用香料、香精。标准中也明确规定了较大婴儿和幼儿配方食品中可使用香兰素、乙基香兰素，最大使用量均为5 mg/100 mL;婴幼儿谷类辅助食品中可使用香兰素，最大使用量为7 mg/100 g，其中100 g和100 mL都以即食食品计，是生产企业按照冲调比例折算成食品中的使用量;而使用范围涵盖0～6个月婴幼儿配方食品不得添加任何食品用香料[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方乳粉、牛奶糖、饮料，均购自本地超市;香兰素标准品（C8H8O3，CAS号121-33-5，天津阿尔塔科技有限公司，编号S087267，100 μg/mL）;甲基香兰素标准品（C9H10O3，CAS号120-14-9，天津阿尔塔科技有限公司，编号S078875，100 μg/mL）;乙基香兰素标准品（C9H10O3，CAS号121-32-4，天津阿尔塔科技有限公司，编号S086815，100 μg/mL）;香豆素标准品（C9H6O2，CAS号91-64-5，天津阿尔塔科技有限公司，编号S077371，100 μg/mL）;甲醇;乙腈（色谱纯）;有机系微孔滤膜（孔径0.45 μm，天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器），Agilent;QUINTIX224-1CN电子天平，德国赛多利斯;V4DS025涡旋混合器，德国艾卡;G-16C高速冷冻离心机，德国赛多利斯;氮气浓缩装置;超声波发生器。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

（1）甲醇-水溶液（4+1）。将甲醇400 mL和水100 mL混合均匀。

（2）盐酸溶液（1 mol/L）。吸取8.33 mL浓盐酸，定容至100 mL水中，临用现配。

1.3.2 试样制备及测定

将牛奶糖粉碎，饮料摇匀备用，乳粉直接用于试样提取。称取1.00 g试样，婴幼儿配方乳粉加入10 mL水和480 μL盐酸溶液，糖果及饮料加入5 mL水，溶解，涡旋振荡1 min，加入乙腈20 mL，涡旋振荡1 min，超声提取30 min后，加入氯化钠5 g，涡旋振荡2 min，8 000 r/min，离心5 min，将上清液转移至玻璃试管，40 ℃氮吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解残渣，过0.45 μm微孔滤膜后，待测[5]。

将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的浓度。

1.3.3 标准品的配制

吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素标准液（100 μg/mL）各1 mL混合成25 μg/mL的溶液，-18 ℃避光保存，保存期3个月。分别吸取适量25 μg/mL混合标准储备液8 μL、40 μL、200 μL、400 μL和1 000 μL，用甲醇-水溶液定容至1 mL，配成浓度为0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和25.0 μg/mL标准工作液。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm;柱温：30 ℃;检测波长：279 nm;流速：1.0 mL/min;进样量：10 μL;流动相：A相为0.5%甲酸溶液，B相为乙腈;梯度洗脱条件见表1。

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限

在1.3.4色谱条件下，对标准工作曲线进行测定，得到4种化合物的线性范围、线性相关系数及回归方程，在3倍信噪比的进样浓度水平下计算检出限。在0.2～25.0 μg/mL，香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的峰面积均与浓度线性关系良好，相关系数均大于0.999 9，检出限为0.05～0.07 mg/kg，结果如表2所示。

2.2 加标实验

以不含香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的奶粉为空白样品基质，分别计算0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.3 mg/kg 3个加标水平下4种化合物的回收率。4种化合物的加标回收率为96.1%～108.7%，结果如表3所示。

2.3 精密度实验

用样品加入0.1 mg/kg混合标准液连续进样6次进行检测，得出精密度为1.27%～3.00%，结果如表4所示。

2.4 食品检测结果

对市售的几种婴幼儿乳粉、牛奶糖、饮料进行检测，结果如表5所示。除婴幼儿配方乳粉、酸奶外，其他几款食品都在配料上标注添加了食用香精。通过表5能看出部分食品都不同程度地检测出了香兰素与乙基香兰素，由于未设定限量，各类食品添加量也不同，往往奶香味越足的食品香精含量也越高。

3 结论与讨论

有研究表明，香兰素、乙基香兰素的少量摄入对人体没有危害，但对于6个月以内的婴幼儿来说，可能会破坏他们的食欲。婴幼儿的身体器官未发育成熟，代谢排毒能力较差，摄入含有食品添加剂的食物会加重其日常代谢的负担。过多摄入，还可能会造成偏食、厌食、挑食等问题，养成不良的饮食习惯。市售的多种奶味饮品、糖果均检测出香兰素，两款饮品检测出乙基香兰素，因此要注意不要过早给婴幼儿食用各种饮品。本文参照GB 5009.284—2021

采用高效液相色谱法测定食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素，标准曲线线性关系良好、方法的检出限及回收率符合相关标准的要求，能满足实验室对食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素以及香豆素的检测要求，可以为有关市场监管部门加强婴幼儿乳粉中香精检测提供技术支持。

参考文献

[1]DE R D A.Dictionary of flavors[M].second edition.New Jersey：Wiley Blackwell，2008.

[2]陶保华，储小军，赖世云，等.婴幼儿配方粉中香兰素和乙基香兰素的检测方法[J].食品安全质量检测学报，2013，4（2）：421-426.

[3]NI Y N，ZHANG G W，KOKOT S.Simultaneous spectrophotometric determination of maltol， ethyl maltol， vanillin and ethyl vanillin in foods by multivariate calibration and artificial neural net works[J].Food Chemistry，2005，89：465-473.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定：GB 5009.284—2021[S].北京：中国标准出版社，2021.