高效液相色谱法测定保健食品中芦荟苷的不确定度评定

摘 要：采用高效液相色谱法测定保健食品中芦荟苷的含量，并根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）和《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）来评定其测量不确定度。以测定原理为基础，建立数学模型，运用测量不确定度的基本评定方法，对影响结果准确度的每个因素进行测量不确定度的计算和评定，以此计算合成不确定度，当置信概率为95%时，得到保健食品中芦荟苷的测量结果为（551.6 ±14.23）mg/kg（k=2）。结果显示，拟合标准曲线所引入的测量不确定度是保健食品中芦荟苷含量不确定度评定的主要来源因素，本文对高效液相色谱法测定保健食品中芦荟苷结果的不确定度评定具有参考作用。

关键词：不确定度;芦荟苷;高效液相色谱法;保健食品

Uncertainty Evaluation of Determination of Aloin in Health Food by HPLC

WU Xi

（Guizhou Provincial Institute for Food Inspection， Guiyang 550001， China）

Abstract： The content of aloin in health food was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）， and the measurement uncertainty was evaluated according to JJF 1059.1—2012 and JJF 1135—2005. According to the measurement principle， a mathematical model was established， and the measurement uncertainty was calculated and evaluated for each factor that affected the accuracy of the results by using the basic evaluation method of the uncertainty in measurement. Thus， the uncertainty was calculated and synthesized. Finally， the measurement result of aloin in health food was （551.6 ±14.23） mg/kg （k=2） when the fiducial probability was 95%. The results showed that the measurement uncertainty introduced by the standard fitting curve was the main source of the uncertainty evaluation of aloin content in health food. This paper can provide reference for the uncertainty evaluation of determination of aloin in health food by HPLC.

Keywords： uncertainty; aloin; high performance liquid chromatography; health food

测量不确定度（Uncertainty of Measurement）是测量结果关联的一个参数，用于表征合理赋予被测量值的分散性。由测量所得的值只是被测量的估计值，测量过程中的随机性及系统性均会导致测量不确定度。完整的测量结果应包含被测量的估计值以及与测量不确定度有关的信息[1]。不确定度评定在实验室检验检测、实验室质量控制以及官方检测报告中越来越受到重视。芦荟苷，又称为芦荟素、芦荟甙，其主要为好望角芦荟、库拉索芦荟、斑纹芦荟等的提取物。芦荟苷具有抗菌性，可以促进血液循环、净化血液、软化血管、降低血液黏度与血压，从而降低动脉硬化和脑溢血的发生率[2]。因此，在保健食品中应用比较广泛。然而，芦荟苷易被分解氧化为芦荟大黄素，芦荟大黄素结构与大黄素相似，这种1，8-二羟基蒽醌结构，有致癌和肾损伤危险[3]。因此，在含芦荟苷的保健食品中测定芦荟苷的含量尤为重要。根据《化学分析不确定度评定》（JJF 1135—2005）和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色谱法对保健食品中芦荟苷的含量进行测定，建立其不确定度的模型，分析在实验过程中所产生的不确定度来源，找到主要的影响因素，以提高检测结果的准确度，为选择芦荟苷含量测定的方法及结果的质量控制提供科学有效的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：型号e2695，Waters;电子天平：型号XS205DU，METTLER TOLEDO;超声波清洗机：型号KQ-500DA，昆山市超声仪器有限公司;芦荟苷标准品：中国食品药品检验研究院，95.0%，110787-201206;甲醇：色谱纯，默克;实验用水为去离子水，纯水制备系统为Millipore公司生产，型号为Milli-Q。

1.2 检测方法

1.2.1 标准溶液的配制

精密称取14.80 mg芦荟苷（中国食品药品检验研究院，95.0%，110787-201206）置于10 mL容量瓶中，加入55%甲醇溶解混匀。准确移取上述溶液1 mL于25 mL容量瓶中，用55%甲醇定容，摇匀待用。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密吸取芦荟苷标准溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和13 μL，依次注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以芦荟苷的量（ng）为横坐标，响应值峰面积（A）为纵坐标建立线性回归方程。

1.2.3 样品制备

将样品混匀，准确称取1 g，置于50 mL容量瓶中，加55%甲醇适量超声5 min，加55%甲醇定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤上机。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：SHISEIDO C18 5.0 μm，4.6 mm×250 mm;柱号：AKAD09668;流动相：55∶45（甲醇∶水）;流速：1.0 mL/min;检测器：紫外检测器;检测波长：293 nm;进样量：10 μL。

2 数学模型

芦荟苷含量计算公式如下：

（1）

式中：X为样品中芦荟苷含量，mg/kg;C为标准曲线上读出的芦荟苷的浓度，μg/mL;V为样品最终定容体积，mL;m样为样品称样量，g。

3 测量不确定度来源分析

由图1知，样品中芦荟苷含量x的合成相对不确定度为：

4 不确定度分量的量化

4.1 样品产生的相对标准不确定度urel（C样）

4.1.1 样品称量引起的相对标准不确定度urel（m）

（1）天平的分辨力u1万分之一的天平，天平的分辨力为0.1 mg，属于均匀分布，不确定度为u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g。

（2）天平的变动性u2称量的变动性引入的不确定度，准确至±0.000 1 g，按均匀分布不确定为，因此芦荟苷样品相对标准不确定度为，则其对样品产生的相对标准不确定度为urel（m）=0.000 064 6。

4.1.2 样品定容过程及样品进样量所引起的相对标准不确定度urel（V）

体积的标准测量不确定度分量主要由容器体积的不确定度、容器和溶液温度与校正温度不同所引起的不确定度组成。

本次试验中样品的定量总体积为50 mL，使用50 mL A级量瓶定容，允许误差分别为±0.05 mL[4]，按照均匀分布换算成标准偏差分别为;

容量瓶和溶液温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度，本次试验中的环境温度与校准时基本相同，此因素引起的不确定度可忽略不计。得出相对不确定度为：

4.2 对照溶液浓度C对的相对标准不确定度分量urel（Cs）

4.2.1 标准溶液配制

56.24 μg/mL芦荟苷对照溶液是由标准品

（1 406 μg/mL）稀释制得。不确定度来源包括对照品本身的不确定度、稀释过程中不确定度和进样量引起的不确定度。

（1）天平的分辨力u1十万分之一的天平，天平的分辨力为0.01 mg，属于均匀分布，不确定度为u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g

（2）天平的变动性u2称量的变动性引入的不确定度，准确至±0.000 01 g，按均匀分布不确定为，因此芦荟苷标准品相对标准不确定度为，则其对标准系列产生的标准不确定度为urel（m标）=0.000 436。

4.2.2 标准溶液稀释时移液产生的标准不确定度urel（C稀）

相对标准不确定度分量主要由容器体积的不确定度、容器充满液体至其刻度的估读误差，以及容器和溶液温度与校正温度不同引起的不确定度组成。

称取0.014 80 g芦荟苷标准品于10 mL容量瓶中，得到近148 μg/mL的标准使用液。稀释过程使用1 mL移液管吸取标准储备液，25 mL容量瓶定容，得到混合标准使用液。1 mL移液管所产生的标准不确定度为[5];25 mL容量瓶的最大允许误差为±0.03 mL，按照均匀分布评定，则;容量瓶和溶液温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度，在本试验中环境温度与校准时相同，该因素引起的不确定度忽略不计。上述不确定度分量相互独立，合成得：

将urel（m标），urel（C稀）合成得urel（Cs）=0.004 12。

4.3 绘制标准曲线求cx时产生的相对标准不确定度urel（L）

按1.2.4高效液相色谱仪的条件，测定芦荟苷的峰面积，线性方程为A=ac+b=2.514 9c+1.801 3，r=1.000 0。

将进样量ng换算成进样体积为10 μL时的浓度曲线分别为cx=55.16 μg/mL，方程为A=25.148 6c+1.801 3，不同浓度下芦荟苷的峰面积如表1所示，线性回归法测量芦荟苷不确定度计算过程如表2所示。

（2）

（3）

则标准曲线绘制过程中，求cx时产生的相对标准不确定度为urel（L）=0.012 2。

式中：u为绘制标准曲线求cx时产生的标准不确定度，μg/mL;a为标准曲线斜率;b为标准曲线截距;p为样品溶液的测定次数;n为标准系列的测定次数;C为标准系列溶液芦荟苷浓度的平均值，μg/mL;Ci为标准系列溶液芦荟苷的浓度，μg/mL;Ai为标准系列溶液的峰面积。

4.4 平行试验重复性引起的相对标准不确定度urel（R）的计算

对样品进行了6次重复测量，进样量10 μL，其测量结果及标准偏差如表3所示。

由表3可知，样品6次重复测量含量的标准偏差为0.003 1，则保健食品中芦荟苷含量的测量标准不确定度为，相对标准不确定度为。

4.5 样品中芦荟苷含量检测的合成相对标准不确定度为urel（x）的评定