浅析酶抑制法在农药残留检测中的应用及酶源的研究进展

摘 要：农药被认为是现代农业的重要组成部分，其在维持高效的农业生产力方面发挥着重要作用，但农药的滥用，也增加了农产品中农药残留超标的风险，从而对人体健康造成危害。本文分析了农药残留检测常用的检测方法，重点阐述了酶抑制法检测原理、检测方法和不同酶源研究进展，旨在为今后农药残留检测技术相关研究提供参考。

关键词：农药残留检测;酶抑制法;酶源

Analysis of the Application of Enzyme Inhibition Method in Pesticide Residue Detection and Research Progress of Enzyme Sources

ZHAO Sujuan1， BAO Qin1， ZHAO Lijie2*

（1.Sichuan Light Industry Research and Design Institute Co.， Ltd.， Chengdu 610084， China; 2.Xi’an Grain and Oil Quality Inspection Center， Xi’an 710000， China）

Abstract： Pesticides are considered to be an important part of modern agriculture. They play an important role in maintaining high-efficiency agricultural productivity. However， the abuse of pesticides also increases the risk of excessive pesticide residues in agricultural products， thereby causing harm to human health. In this paper， the common detection methods for pesticide residue detection were analyzed， and the detection principle， detection methods and research progress of different enzyme sources were mainly described， in order to provide reference for the future research on pesticide residue detection technology.

Keywords： pesticide residue detection; enzyme inhibition method; enzyme source

1 农药残留及其危害

我国一直以来都是以农业为主导的国家，在全球化的推动下，大量的农产品开始向海外输出。作为一个农业大国和出口大国，我国在食品安全和农产品安全方面的问题日益突出。在农业现代化的发展过程中，农药在维持高效的农业生产力方面发挥着重要作用。因此，广泛使用农药管理生产是高投入集约化农业生产系统的主要特征[1]。科学合理使用农药能达到对农产品的防病、防虫害效果，同时也能保证稳定生产农产品，有效增加产品产量和避免巨大的农业经济损失[2-4];但不合理投入使用农药会对农产品造成污染，农药会残留在作物表面（茎、叶、果实和根等部位）。如今，人们的消费能力不断增强，食品安全问题也多次敲响警钟，人们越来越关注农药残留带来的危害，如HADIAN等[5]分析了不同化学结构的48种农药残留物包括有机氯、有机磷、有机氮和拟除虫菊酯等其他化学基团在水果和蔬菜中的农药残留情况;DIOPA等[6]对达克尔地区的农药残留现状进行了分析检测，多份样品被检出农药残留，从检出率结果可以得出，应指导种植者合理使用农药，并严控农药的使用量。为保障人们的身体健康，也应重视对农药残留量的检测以及其检测技术的开发与研究。

2 农药残留检测方法

目前，市场对农产品农药残留量的检测提出了更多的要求，使用快速、有效、方便和低成本的手段得出结果的农药残留检测技术逐渐符合我国目前的市场要求。已知的农药残留检测方法有多种，目前使用较多的方法大致分为经典方法与快检方法。经典方法能够定性、定量分析样品中农药残留量，一般需使用大型的精密仪器才能有效检测样品，主要包括色谱法（气相色谱法、液相色谱法）[7-10]、色谱与质谱联用法[11]，分析范围广，能对样品进行多通道分析，也有利于样品的多种农药残留组分分析，具有仪器灵敏度高、检测限低等特点。经典法是目前使用较多也是较为成熟的检测方法，在环境、生物、化学和药学等领域都有深入的应用。经典仪器法对检测人员的技术要求高，对样品的前处理要求严格，仪器使用前后的设备维护成本高，且检测样品农药残留所需时间长，其更适合监督检测部门使用而不适宜基层部门在市场中对快销农产品进行农药残留检测。快检方法可实时实地快速检测产品是否合格，其配套仪器简单、耗材成本低，对检测人员技术要求低，在农贸市场、农产品生产地、果蔬销售门店、超市和家庭等地方都能进行检测，常用的快检方法有酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[12]、生物传感器法[13]、酶抑制法[14-15]等。

3 酶抑制法

酶抑制法在农药残留检测中的应用是在1951年提出的，其应用广泛也较早。酶抑制法的主要检测原理是有机磷类、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶与羧酸酯酶等有很强的抑制力，能进一步影响酯酶酶促反应中酶与底物的反应过程，从而影响底物与显色剂的反应，这种显色反应可在生物体外反映出农药的抑制力[16-17]。在整个反应过程中，可观察到酶促反应体系会产生一定的颜色变化，或酶与某些特定化合物结合后其理化信号强弱会发生变化，从而判定样品中是否含有农药以及农药残留量是否超标。一般情况下，在体外的实验检测中，农药的添加会使检测用酶的酶活受到一定的影响，当提高农药的添加量时，所用酶的酶活性会减小，酶对底物水解后生成的底物累积量与酶活性成正相关，酶活力越大，产物就越多。近年来，市场上使用的农药残留检测技术、农药残留检测设备大多是基于酶抑制法的原理设计。目前市场上已研制出多种基于酶抑制法原理的农药残留快速检测试剂盒，且国外多个国家也将这类试剂盒作为在田间进行初步筛查农药残留量的主要手段。酶抑制法具有方法简单易于操作、成本低、检测用时短、可行性高和样品检测量大等特点，大部分方法对样品的要求不高，简单处理后即可检测，适合基层执法人员、家庭及个人使用。酶抑制法目前是市场使用最广泛的方法，国内也出台了多个标准指导其使用，如GB/T 18625—2002、GB/T 18626—2002、GB/T 18630—2002等。因此，酶抑制法是农药残留快检技术中一种非常重要的检测方法。

4 酶抑制法快检方法

4.1 分光光度法（比色法）

分光光度法的检测原理为提取的样品溶液与酶液反应一段时间后，加入底物与显色剂，在有机磷类农药或氨基甲酸酯类农药的作用下，检测酶液的酶活会受到抑制从而影响酶促反应，再利用配套的仪器设备比色分析，判断样品溶液中的农药残留含量是否超标[18-19]。此类基于酶抑制法的快速检测方法由于其技术要求不高，使用人员经简单培训后即可掌握，因此该方法也是我国使用最多的方法，在市场中受到基层执法人员的欢迎。

4.2 试纸法

预先将酶与底物或与底物类似的物质经处理后固定在滤纸片上，检测时将待测样品溶液置于固定化后的纸片上，通过目测纸片上的颜色深浅再对比分析，从而判定样品农药残留含量情况。常用的底物为靛酚乙酸酯，当酯酶与靛酚乙酸酯发生酶促反应后，会生成蓝色的靛酚与乙酸物质，靛酚在纸片上会显现出蓝色，样品农药残留含量越高在纸片上显现的蓝色会越浅，经过测试后的纸片一般会出现蓝色、浅蓝色、白色这几种层次的颜色。该方法用时短、成本低，常用于果蔬农药残留快检[20]。

4.3 酶传感器法

生物敏感器件与传感器相结合时，可用于分析一些特定的化学物质。生物敏感器件的主要作用是与待检化合物发生物理化学反应，传感器是将这种反应转换放大为一种可记录与分析的信号。利用这一特点，可研制出能用于检测农药残留的酶传感器从而应用于快检市场中[21]。此类基于酶抑制法的酶传感器的响应值大小一般是由酶与底物相互作用的效果决定的，因此该方法对酶活和底物的要求较高，底物在反应中具有重要作用，要拓展传感器的使用，选择合适的底物是一个重要标准。AChE和BChE这两类酶催化水解产生的特异性底物乙酰胆碱盐和丁酰胆碱盐是电位检测的优先选择底物。生物传感器的使用效果一般用酶负载量、pH值范围、灵敏度和重复性等因素来表示，因此在开发研制酶传感器的过程中，确定这些参数的最优值非常关键。

5 酶抑制法酶源

酶抑制法检测有机磷类、氨基甲酸酯类等农药的敏感性与酶、底物、显色剂、反应温度、时间和pH等因素有关，酶是影响该检测技术灵敏度、可行性、可靠性和准确性的关键因素[22]。目前，国内对酶抑制法酶源的研究主要是动物酶源和植物酶源。动物酶源中提取的酯酶为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。乙酰胆碱酯酶是从动物的红细胞或神经组织中分离出的，目前对它的研究最具影响力的是从美洲蟑螂的大脑中提取的酯酶。丁酰胆碱酯酶的主要来源为动物血清和肝脏，其中最具代表性的是从鸡血清中提取的酯酶[23]。

目前，针对我国使用的有机磷、氨基甲酸酯类农药，以乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶作为酶抑制法的酶源最为适宜，但乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶主要来自动物体内，且价格昂贵，不易长时间保存，远达不到我国农药快速检测的需要。植物酯酶由于来源广泛、取材方便、成本低以及制备简单，已引起众多学者的广泛关注。近年来，有关植物酯酶对农药的敏感性的研究表明，其对农药检测的灵敏度不亚于动物酯酶，部分植物酯酶甚至比动物酯酶更敏感[24]。针对目前我国存在的农药残留问题，迫切需要开发一种通用、行之有效的农药残留量检测技术，以促进农药残留的快速测定。因此，资源丰富、价格低廉的植物酯酶成为人们的首选[25]。

参考文献

[1]TILMAN D，CASSMAN K G，MATSON P A，et al.Agricultural sustainability and intensive production practices[J].Nature，2002，418（6898）：671.

[2]O’Keefe M.Residue analysis in food： principles and applications[M].London：CRC Press，2000.

[3]COOK N D，LEWIS J N.The pesticide problem： an economic approach to public policy[M].London：Routledge，2015.

[4]O’KEEFFE M，KENNEDY O.Residues–a food safety problem？[J].Journal of Food Safety，1998，18（4）：297-319.

[5]HADIAN Z，ESLAMIZAD S，YAZDANPANAH H.Pesticide residues analysis in iranian fruits and vegetables by gas chromatography-mass spectrometry[J].Iranian Journal of Pharmaceutical Research，2019，18（1）：275.

[6]DIOP A，DIOP Y M，THIARE D D，et al.Monitoring survey of the use patterns and pesticide residues on vegetables in the Niayes zone， Senegal[J].Chemosphere，2016，144：1715-1721.

[7]LEE S M，WYLIE P L.Comparison of the atomic emission detector to other element-selective detectors for the gas chromatographic analysis of pesticide residues[J].Journal of agricultural and food chemistry，1991，39（12）：2192-2199.