基于UPLC-Q-TOF-MS技术分析西藏凹乳芹的化学成分及定量分析研究

摘要：目的：采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术，对凹乳芹中的主要酚类成分进行分析鉴定，并建立高效液相色谱（HPLC）定量分析方法。 方法：采用Waters BEH C18，以0.1%甲酸水（A） -乙睛（ B）为流动相进行色谱分离，流速0.3 mL/min，检测波长为320 nm，负离子模式下扫描采集数据，快速识别和鉴定凹乳芹中的化学成分。根据鉴定的结果建立HPLC定量分析方法以用于凹乳芹的质量评价。结果：从凹乳芹中鉴定出19个化学成分，并建立了新绿原酸、绿原酸、阿魏酸和异绿原酸A的定量分析方法。结论：该方法为凹乳芹的化学成分质谱裂解规律和质量评价提供了科学依据。

关键词：西藏凹乳芹；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱；多酚；定量分析西藏凹乳芹（Vicatia thibetica）为伞形科凹乳芹属植物凹乳芹的根，主要分布于拉萨、昌都、日喀则、山南和察隅等地，在四川和云南的西北部等地区也有分布[1]。西藏凹乳芹性温，味辛、甘、微苦[2]，为藏药五大根药之一，其根被用做炖汤调料，叶片则被做藏芹菜制成美味佳肴。研究表明，西藏凹乳芹根含有阿魏酸、川陈皮素、异甘草素和多糖等活性成分[3-4]，用于治疗月经不调、痛经、消化不良和贫血等[5]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，对西藏凹乳芹的成分进行分析，并建立主要化学成分的高效液相色谱定量分析方法，为西藏凹乳芹的开发利用提供科学依据。

1仪器与试剂

Waters Xevo G2-XS QTOF，美国Waters公司；超高液相色谱1290，美国安捷伦公司；FY-250中药粉碎机，永康市久品工贸有限公司；Gentrifuge 5180R高速冷冻离心机，德国eppendorf公司；FW-100型高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；KH2200DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UPT-11-2T优普系列超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司。

凹乳芹（采收时间2021年）；新绿原酸、绿原酸、阿魏酸、异绿原酸A（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；甲醇（分析纯），成都市科龙化工试剂厂；乙腈、甲醇（色谱纯），美国MREDA公司。

2方法

2.1供试品溶液的制备

凹乳芹烘干打粉，过60目，称取0.4 g，加入3 mL 80%甲醇40 ℃超声40 min，6 000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣重复提取2次，合并定容至10 mL，0.22 μm滤膜过滤备用。新绿原酸、绿原酸、阿魏酸、异绿原酸A对照品20 mg用甲醇溶解定容至10 mL，以二倍稀释法制备不同浓度的对照品溶液，冷藏备用。

2.2UPLC-Q-TOF-MS分析条件

色谱条件：Waters BEH C₁₈（2.1×100 mm，1.7 μm）色谱柱，检测波长：320 nm；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；流动相：0.1%甲酸-水溶液（A）、乙腈（B）；洗脱条件：0～2 min，B：5%～10%；2～10 min，B：10%～20%；10～15 min，B：20%～40%；15～17 min，B：40%～70%；17～20 min，B：70%～95%。

质谱条件：负离子模式采集数据，电压是2.5 kv，脱溶剂气流速600 L/h，锥孔气流速50 L/h，离子源温度250 ℃，离子源脱溶剂气温度120 ℃，样品锥孔电压40 V，离子源缺省电压80 V，分子量范围：m/z 50～1 500。

2.3超高液相色谱定量分析条件

色谱条件：采用梯度洗脱， Poroshell 120 PFP 2.7 μm C₁₈柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；检测波长：320 nm；柱温：35 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：5 μL；流动相：0.1%甲酸-水溶液（A）、乙腈（B）；洗脱条件：0～10 min，B：5%～10%；10～20 min，B：10%～20%；20～27.5 min，B：20%～30%；27.5～32 min，B：30%～90%；32～40 min，B：90%（图1、图2）。

经HPLC分析后，根据供试品各化合物峰面积及标准曲线（表1）按式（1）计算含量。

W=C·D·V／m （1）

式（1）中，W—含量（μg/g）、C—样品浓度（μg/mL）、D—稀释倍数、V—样品体积（mL）、m—样品质量（g）。

3结果与分析

3.1酚酸类化合物的UPLC-Q-TOF-MS分析

通过化合物的一级、二级质谱及裂解规律并结合对照品比对、相关文献检索进行综合分析，实现目标化合物的鉴定和确证。凹乳芹甲醇提取物负模式的质谱基峰离子流图见图3，通过UPLC-Q-TOF-MS，从凹乳芹的质谱总离子流图中鉴定出19个酚酸类化合物，分别是咖啡酰奎尼酸、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸和阿魏酸二聚体等，其中，4个化合物通过与对照品进行明确识别。鉴定的各化学成分的保留时间、质谱信息见表2。在负离子模式下，共鉴定出19个酚酸和酚酸糖苷类化合物，化合物1（保留时间0.860 min）和2（保留时间1.041 min）的准分子离子峰为m/z 191.0179 [M-H]^—，根据相关文献[6]，结合二级质谱裂解规律推测为奎尼酸和柠檬酸。化合物9（保留时间4.883 min）的准分子离子峰为m/z 179.033 3 [M-H]^—，二级质谱产生的碎片m/z 135[M-H-CO₂]^—是脱去CO₂所得，确定为咖啡酸。化合物3、6、8的保留时间分别是3.119、4.213、4.612 min，为同分异构体，准分子离子峰为m/z 353[M-H]^—，共同碎片离子由失去咖啡酰基得m/z 191[奎尼酸-H]^—，为咖啡酰奎尼酸类化合物，通过与对照品比对，化合物3和6分别确定为5-咖啡酰奎尼酸（新绿原酸）和3-咖啡酰奎尼酸（绿原酸），结合文献数据[7]，推测化合物8为4-咖啡酰奎尼酸（隐绿原酸）。化合物4、5、14的保留时间分别是3.123、4.102、8.701 min，准分子离子峰为m/z 341[M-H]^—，也为同分异构体，二级质谱的碎片离子m/z 179[咖啡酸-H]^—和m/z 135[咖啡酸-H-CO₂]—为失去1分子葡萄糖和CO2所得，推测为咖啡酰葡萄糖苷类化合物。化合物16（保留时间10.727 min）的准分子离子峰为m/ z 515.123 4 [M-H]^—，碎片离子m/z 353[咖啡酰奎尼酸-H]^—、m/z 179.033 3 [咖啡酸-H]^—和m/z 191[奎尼酸-H]^—提示该化合物为二咖啡酰奎尼酸，通过与对照品比对，化合物16确定为3，5二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸A）。根据分子式和二级质谱裂解规律可以推断化合物15和17也是二咖啡酰奎尼酸，参考相关文献和色谱保留时间[8]，化合物15和17推测为3，4二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸B）和4，5-二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸C）。

化合物12（保留时间8.040 min）的准分子离子峰为m/z 193.049 8 [M-H]^—，失去甲基和CO₂得到碎片离子m/z 178[M-H-CH₃]^—和m/z 134[M-H-CH₃-CO₂]^—，通过与对照品比对，化合物12确定为阿魏酸。化合物7的保留时间为4.604 min，准分子离子峰为m/z 367.106 8[M-H]^—，二级质谱中基准峰为m/z 193[阿魏酸-H]^—，阿魏酸失去1分子水和CO2得碎片离子m/z 134 [阿魏酸-H -H₂O-CO₂]^—，与文献报道一致[9]，被鉴定为3-阿魏酰奎尼酸。化合物10和11的保留时间分别是4.604 min和6.590 min，与化合物7为同分异构体，鉴于4-阿魏酰奎尼酸和5-阿魏酰奎尼酸二级质谱中基准峰分别为m/z 173和m/z 191[10]，化合物10和11被鉴定为为4-阿魏酰奎尼酸和5-阿魏酰奎尼酸。

化合物13（保留时间8.073 min）和18（保留时间15.276 min）的准分子离子峰分别为m/z 547.141 6 [M-H]^—和547.117 6[M-H]^—，分子式为C₂₆H₂₇O₁₃，失去1分子葡萄糖得碎片离子m/z 385[M-H-C₆H₁₀O₅]^—，碎片离子m/z 193[阿魏酸-H]^—、m/z 178[阿魏酸-H-CH₃]^—和m/z 134[阿魏酸-H-CH₃-CO₂]^—提示该化合物含有阿魏酰基团，根据相关文献[11]，推测化合物13和18为阿魏酸二聚体-O-葡萄糖苷。化合物19（保留时间15.277 min）的准分子离子峰为m/z 577.130 0 [M-H]^—，二级质谱产生碎片离子m/z 385[M-H-C₁₀H₈O₄]^—、m/z 193[阿魏酸-H]^—、m/z 178[阿魏酸-H-CH₃]^—和m/z 134[阿魏酸-H-CH₃-CO₂]_—，结合参考文献[12]，推测化合物19为阿魏酸三聚体。

3.2超高液相色谱定量分析与讨论

新绿原酸、绿原酸、阿魏酸和异绿原酸A是凹乳芹的主要成分，其中绿原酸类化合物是凹乳芹重要的生理活性成分。绿原酸是植物细胞通过莽草酸途径合成的一种苯丙素类物质，这类化合物广泛存在于金银花、杜仲等植物[13-14]，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和降血脂等多方面的药理作用[15-17]。由表3可知，4种活性成分中绿原酸的含量远高于其他3种活性成分含量，这一点在所有能够检测到的样品中均能够得到体现。新绿原酸和异绿原酸A的含量次之，而阿魏酸含量最低。16个样品中有10个样品检测到新绿原酸，13个样品检测到绿原酸，12个样品检测到阿魏酸，7个样品检测到异绿原酸A，其中新绿原酸含量在105.97～201.06 μg/g之间，平均含量为148.56 μg/g，绿原酸含量在290.01～1 250.52 μg/g之间，平均含量为483.88 μg/g，阿魏酸含量在27.51～111.10 μg/g之间，平均含量为45.32 μg/g，异绿原酸A含量在82.51～208.73 μg/g之间，平均含量为130.20 μg/g。结合16个样品来看，来自于丁青的样品新绿原酸、绿原酸、阿魏酸、异绿原酸A含量均为最高，品质最优，在014和015样品中均未检测到4种活性成分，品质相对较差。此外，由006和007 2组样品的含量可以看出，来自于内地和藏区的不同品种生长在同一地区其功能成分含量也不尽相同。来自于内地的品种仅检测到阿魏酸，且其含量明显低于藏区品种，而来自于藏区品种仅有异绿原酸A未检出，其他3种功能成分含量均在较高的水平上。

4结论与讨论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，对凹乳芹中的主要酚类成分进行了快速识别和鉴定，从凹乳芹中共鉴定出19个化学成分，其中咖啡酰奎尼酸、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸、阿魏酸二聚体和三聚体是首次在凹乳芹中被发现，并建立了新绿原酸、绿原酸、阿魏酸和异绿原酸A的HPLC定量分析方法。绿原酸类化合物是凹乳芹的主要活性成分，表明凹乳芹具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和降血脂等药理作用。本研究为凹乳芹的化学成分质谱裂解规律和质量评价提供了科学依据。参考文献

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