利用曲面响应法优化金针菇中维生素D2紫外转化的工艺

食物中的维生素D主要是在紫外线照射后获得，因此被称为“阳光维生素”，在人体代谢过程中发挥着重要作用。多项研究表明，食用菌经过紫外线照射后，其中维生素D2的含量会出现不同程度的升高，但是转化率会受影响，因此需对转化条件进行优化，最大限度地提高食用菌中维生素D2的含量。曲面响应是一种常用的统计方法，可以在受多因素影响的问题中，利用模型获得最佳解决方案。目前，尚无利用曲面响应法优化金针菇紫外转化条件的报道，故本文以金针菇为材料，优化紫外转化条件，以期为金针菇中维生素D的开发和利用提供理论依据。

1. 材料与设备

1.1 材料与试剂

食用菌（购自南昌农贸市场）；维生素D2标准品（COOLBJC，纯度99%，10mg）；甲醇（SIGMA，色谱纯）；乙腈（SIGMA，色谱纯）；无水乙醇（SIGMA，分析纯）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Agilent 1260）；高效液相柱（ZORBAX 300SB-C18）；精密电子天平；冻干机（霍尔德HD-LG10A）；超声机（尚仪SN-QX-08E）；紫外灯（星创紫光）。

2. 实验与方法

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX 300SB-C18（4.6×100mm，3.5μm）；流动相：甲醇：水（95：5）；流速：1mL/min；检测波长：282nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.2 样品处理

精确称取1.0g金针菇子实体粉末，加入10mL无水乙醇，60℃超声提取15min，静置沉淀，移取上清。之后向残渣中继续加入10mL无水乙醇，60℃超声15min，合并上清，离心10min，无水乙醇定容至10mL即得。

2.3 单因素试验设计

2.3.1 时间。准确称取100g金针菇子实体3份，在30℃、紫外线UVB波段下，分别照射15、20、30、60、90、120min，立即冷冻干燥，按照提取方法提取后进行色谱分析，每个重复3次。

2.3.2 温度。准确称取100g金针菇子实体3份，分别置于10、20、30、40、50、60℃环境下，给予紫外线UVB波段处理60min，立即冷冻干燥，按照提取方法提取后进行色谱分析，每个重复3次。

2.3.3 波长。准确称取100g金针菇子实体3份，在30℃环境下分别给予UVA、UVB、UVC波段紫外线处理60min，立即冷冻干燥，按照提取方法提取后进行色谱分析，每个重复3次。

2.4 Box-Benhnken中心组合试验设计

在单因素试验的基础上，选择对维生素D2含量影响较大的三个因素，利用Design-Expert 13软件设计三因素三水平的响应面试验，如表1所示。

3. 结果与分析

3.1 维生素D2标准曲线绘制

以峰面积为纵坐标、维生素D2浓度为横坐标，得出标准曲线及回归方程为：Y=31125x- 4314.9，R2=0.9994，线性范围为1.0-40μg/mL，维生素D2浓度与峰面积之间存在良好的线性关系。

3.2 单因素试验结果分析

3.2.1 时间。不同照射时间下，维生素D2的含量会随时间增加呈现先上升后下降的趋势。在15、20、30、60、90、120min的维生素D2含量分别为28.18、35.79、49.46、52.71、47.32、46.27μg/g，在60min时含量最高，故最适时间选择为60min。

3.2.2 温度。在不同温度影响下，维生素D2的含量随温度升高呈现先上升后下降的趋势。在10、20、30、40、50、60℃温度下维生素D2的含量分别为13.11、18.21、23.28、18.6、16.45、14.89μg/g，在30℃时含量最高，故最适温度选择为30℃。

3.2.3 波长。不同紫外波长对维生素D2含量的影响十分明显，在UVA、UVB、UVC的含量分别为0.65、18.6、392μg/g，在UVC波段含量增长最明显，故最适波段选择为UVC。

3.3 曲面响应试验结果分析

3.3.1 响应面设计方案及结果。基于单因素试验结果，以时间（A）、温度（B）、波长（C）为自变量，维生素D2含量（Y）为响应值，对金针菇中维生素D2进行响应面试验优化，结果如表2所示。

3.3.2 回归方程拟合及方差分析。采用Design-Exper 13软件对所得数据进行分析，回归分析结果如表3所示。对各因素回归拟合后，得到回归方程为：Y=418.2-7.47A-5.94B+22.87C+11.33AB+2.16AC-1.03BC-46.47A2-45.48B2-347.34C2

回归模型的R2=0.9983，R2adj=0.9961。由方差分析可知，回归方程模型显著（P＜0.01），说明模型与实际拟合良好，方法可靠；失拟合不显著（P＞0.05），说明所得方程与实际拟合中非正常误差占比小，可用该回归方程进行分析。

3.3.3 响应面图分析。因素交互作用响应面和等高线如图1所示，通过该组图对任意两因素的交互影响进行分析，从中确定最佳因素范围。

通过响应面实验，分析得到维生素D2最佳工艺参数为：时间90min、温度30.5℃、波长257.7nm，在此条件下维生素D2的理论含量为364.87μg/g。为验证模型所得最佳工艺参数的可行性，采用上述参数进行验证实验，考虑到实际操作，调整参数为：时间90min、温度31℃、波长254nm，通过3组平行实验得到维生素D2的含量为361.32μg/g，与模型预测值接近，证明响应面试验所得工艺条件可行。

综上所述，本研究在单因素的基础上，以维生素D2含量为指标，通过响应面法对金针菇紫外转化的工艺进行优化，最终得到的参数为：时间90min、温度31℃、波长254nm，为富含维生素D2的金针菇产品的开发和利用提供了一定的参考。

课题项目：2020年度江西省教育厅科学技术研究项目“五种常见食用菌中麦角甾醇生成维生素D的条件研究”（GJJ207606）。

作者简介：万安露（1991-），女，汉族，江西南昌人，讲师，硕士研究生，研究方向为药物分析。