HPLC-QTOF测定保健食品及中成药 中非法添加降糖类化学药物的方法研究

近年来，2型糖尿病患者人数在我国有显著上升趋势，而降血糖类保健食品或中成药作为重要的辅助治疗手段，却时有被检出非法添加降糖药物的情况。目前用于检测非法添加降糖药物的常见技术有薄层色谱、近红外光谱、表面增强拉曼光谱、液相色谱、电喷雾离子迁移谱、核磁共振法和液相色谱-质谱联用等，而高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF）联用技术可通过多级质谱联用技术提供分子离子峰的碎片信息，并能对未知化合物进行筛查和确证，特别适用于对保健食品及中成药等复杂体系的研究，能够有效降低非法添加漏检的可能性。本文采用HPLC-QTOF检测技术，在原国家食品药品监督管理总局颁布的三个筛查非法添加降糖药物批准件（2009029、2011008、2013001）的基础上，制定了筛查保健食品和中成药中18种非法添加降糖药物的定性定量检测方法。

一、材料

1.仪器。Direct-Q5UV超纯水系统，密理博公司；Mettler XS205DU电子天平，梅特勒公司；安捷伦6530液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱、Mass Hunter软件，Agilent公司；KQ-250DE超声仪，昆山市超声仪有限公司。

2.对照品。13种降糖物质混合对照溶液（二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、罗格列酮、吡格列酮、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齐特、格列波脲、格列苯脲、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮，浓度均为100µg/mL），购自坛墨质检标准物质中心；达格列净、卡格列净，购自坛墨质检标准物质中心；那格列奈、维格列汀、阿卡波糖，购自中国食品药品检定研究院。

3.试剂。甲醇、乙腈（色谱纯），美国霍尼韦尔公司；冰醋酸（色谱纯），德国Merck公司。

二、条件

1.对照品溶液制备。分别精准称取达格列净、那格列奈、卡格列净、维格列汀、阿卡波糖对照品适量，用50%甲醇溶解稀释，制成5种混合对照品溶液（100µg/mL）。分别精密量取13种混合对照溶液（100µg/mL）和上述5种混合对照品溶液（100µg/mL）各2mL于20mL容量瓶中，用50%甲醇稀释定容，制成混合对照储备液（10µg/mL）。

2.样品溶液制备。待测样品为保健食品及中成药，共20批，均为市场抽检样品。精密称取研细的待测样品1g，置于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液，超声提取15min，冷却至室温后，用50%甲醇溶液稀释定容，摇匀，用0.22µm滤膜过滤后备用，必要时需根据检测过程中非法添加物的浓度调整样品稀释倍数。

3.色谱条件。色谱柱为安捷伦EC-C18柱（150mm×3.1mm，2.7µm），柱温40℃；流动相A为0.1%乙酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0-15min，A：90%-60%；15-25min，A：60%-10%；25-30min，A：10%；30-31min，A：10%-90%；31-40min，A：90%。

4.质谱条件。ESI离子源，雾化器（N2）为241kPa，干燥气（N2）流速为12L/min，温度为200℃，毛细管电压为3.5kV，碎裂电压为160V。采集模式：正离子模式，扫描范围为100-1000，二级质谱碰撞池能量为20eV。

三、实验方法学考察

1.精密度。取混合对照品溶液（1µg/mL），连续进样5次，根据峰面积计算精密度。结果显示，各化合物峰面积RSD为0.53%-2.69%（n=5），表明精密度良好。

2.线性关系与检出限。取混合对照品储备液，分别加入50%甲醇稀释配制成质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10µg/mL的系列标准溶液，各成分从中选取5个浓度，以质量浓度为横坐标（X，µg/mL）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明，各成分在一定浓度范围内均呈现出良好的线性关系，相关系数r均大于0.99（表1）。

3.稳定性。取混合对照品溶液（1µg/mL），在放置0h、6h、12h、24h后分别测定各化合物峰面积。结果显示，18种化合物的峰面积RSD为1.05%-3.23%，表明各化合物在24h内基本保持稳定。

4.加样回收率。称取未检出降糖类药物的阴性片剂粉末1.0g，分别精密加入18种混合对照品溶液（10µg/mL）0.8mL、1.0mL、1.2mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇溶液，超声溶解，稀释至刻度。每个浓度制备3份平行样品，测定各化合物峰面积并计算回收率及RSD（%），结果详见表2。

5.样品测定。对抽检的20批保健食品及中成药样品进行测定，有3批样品中检出了非法添加降糖类药物，添加药物种类为格列本脲、盐酸二甲双胍，其中有2批样品同时检出格列本脲（450.5mg/kg、602.7mg/kg）、盐酸二甲双胍（70.3mg/kg、100.2mg/kg）两种非法添加物，1批样品检出盐酸二甲双胍（60.5mg/kg）。降糖药物非法添加含量较高，添加剂量随意且不确定，会对消费者健康产生较大危害。

四、讨论

1.流动相系统优化。通过文献参考及预实验，分别考察水-甲醇、水-乙腈、0.1%乙酸溶液-乙腈、0.01mol/L乙酸铵-甲醇流动相系统对化合物分离情况及质谱响应值的影响，最终选取0.1%乙酸溶液-乙腈作为流动相，可将18种化合物有效分离，也可获得较高质谱响应。18种化合物总离子流色谱如图1所示。

2.色谱柱选择。分别选择安捷伦EC-C18色谱柱、Ultimate XB-C18色谱柱、XBridge C18色谱柱进行试验，结果发现采用安捷伦EC-C18色谱柱可以取得满意的峰形、分离度和响应情况。

综上，本文建立的方法前处理操作简单，结果准确，且能将3个批准件筛查范围从13种化合物扩大到18种化合物，并对色谱条件等进行优化，缩短了检测时间，提高了检测效率，可应用于降糖类保健食品和中成药非法添加的日常监督检验。

基金项目：金华市科技计划公益类项目“基于HPLC-QTOF技术降糖类药物数据库的构建及其在食品药品非法添加中研究”（2020-4-094）。

作者简介：朱洁（1983-），女，汉族，浙江金华人，讲师，硕士研究生，研究方向为药物分析教学。

*通信作者：舒展（1984-），男，汉族，浙江金华人，主管药师，硕士研究生，研究方向为药物分析。