饼干中菌落总数不确定度评定

Evaluation of the Uncertainty in the Total Bacterial Count in Biscuits

， ， ， ， ， Food Inspection Centre， Kunming Institute for Food and Drug Control， Kunming 65oo34， China）

Abstract： To ensure the accuracy and scientific validity of the total bacterial colony count detection results in biscuits，an uncertainty evaluation method for the colony count in biscuits is established.Based on the GB 4789.2—2O22 plate count method，the colony count is tested，and the uncertainty introduced during the testing processis evaluated.The results show that the combined standard uncertainty of the total colony count detection is 0.056 O06，with an expanded uncertainty of 0.116 829 at a 95% confidence level. The confidence interval is between 60 684 CFU g^-1 and 103928CFU⋅g^-1 ，and the detection data follows a normal distribution. Analysis revealed that the relative standard uncertainty introduced by dilutionand repeatability testing is relatively high.It is recommended to reduce the uncertainty by strictly controling factors such as operator handling，instrument precision，and environmental conditions.

Keywords： biscuits; total bacterial count; evaluation of the uncertainty

饼干作为一种常见的便捷食品，不仅具有多样化的口味和质地，还富含多种营养成分。因其便携性、长保质期和多样化的选择，成为现代快节奏生活中重要的能量补充来源。如果食用被微生物污染的饼干，可能会对健康造成一系列的负面影响。菌落总数是食品微生物污染程度的一个重要监测项目，也是评价食品卫生状况和质量安全最常用的指标，其结果直接影响评价的准确性和可靠性[1]。不确定度是与测量结果相关联的参数，用以表征合理赋予被测量值的分散性[2]，是评估检测结果可靠性的关键指标，不确定度越小，检测结果越接近真值，其使用价值也越高，反之不确定度越大，检测结果的可靠性越低。《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T27025—2019）3和《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》CNAS-CL01-A001：2022）4都对实验室检验结果的测量不确定度提出了要求，通过对不确定度来源的分析和评定，可以明确检测过程中的关键控制点，为优化检测方法提供依据。

本研究通过对饼干中菌落总数的不确定度评估，旨在科学表征检测结果，特别是在临界值附近时降低检测风险，以期为实验室检验检测结果的科学表征及检验检测过程的质量控制提供科学依据[5]。

1材料与方法

1.1材料与试剂

平板计数琼脂培养基（230520），北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠（210409），国药集团化学试剂有限公司；饼干（样品），市售。

1.2仪器与设备

高压蒸汽灭菌器（MLS-3781L-PC），上海松下；恒温恒湿培养箱（HPP260），德国美墨尔特；拍击式均质器（HBM-400B），恒奥；移液枪（ 100～ 1000μL 、 1～10mL ），艾本德；电子天平（ScoutPro），奥豪斯仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 菌落总数的测定

按照《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB4789.2—2022）平板计数法，取同一品牌、同一批号的20份酥性饼干样品，每份样品做2平行，均由同一名技术人员进行检测。依据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059.1—2012）[7]对检测结果进行不确定度评定。

1.3.2 数学模型的构建

依据检测方法，构建数学模型为

Y=A×D

式中： Y 为样品中菌落总数， CFU⋅g^-1 ; A 为计数样品稀释度； D 为计数稀释样本的菌落数，CFU g^-1 。

1.3.3 不确定度来源分析

不确定度主要分为A类和B类。A类不确定度主要由样品重复性检测的操作过程引入，B类不确定度则主要来源于称样、稀释和加样等过程，其中量器校准误差和温度变化导致的体积偏差是其主要来源。

2 结果与分析

2.1B类不确定度评定

2.1.1 称样引入的相对标准不确定度

依据电子天平校准证书，测量点在 1～ 100g 时扩展不确定度 U=0.1g ，包含因子 k=2 ，实验过程中需称取饼干 25g ，则相对标准不确定度为

2.1.2稀释引入的相对标准不确定度

根据《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB4789.2—2022）[，本实验称取样品后，将其置于含 225mL 生理盐水的均质袋中均质混匀，制成 1：10 的样品匀液。随后，用 1mL 移液枪吸取 1：10 样品匀液注入 9mL 生理盐水中，混匀制成 1：100 的样品匀液，此稀释步骤重复两次，最终获得 1：1000 的稀释度。在稀释过程中，使用 250mL 量筒量取 225mL 生理盐水， 10mL 移液枪吸取 9mL 生理盐水，以及 1mL 移液枪吸取1mL 样品匀液。不确定度主要来源于校准误差和温度变化引起的体积偏差。依据《常用玻璃量器》（JJG196—2006）[8]，在 20^∘C 下， 250mL 量出式量筒的容量允差 ±2.0mL （ a=2.0mL ），检定证书显示，10mL 移液枪容量相对误差为 0.5% （ a=0.05mL ），1mL 移液枪相对容量误差为 0.5% （ a=0.005mL ），均取矩形分布 ，由此校准引入的相对标准不确定度分别为

由于量筒的膨胀系数远远小于水的膨胀系数，因此仅需评估温度变化对水体积的影响。水的膨胀系数α 为 2.1×10^-4∘C^-1 ，实验温度控制在（ 20±3 ） ^∘C 。在量取 225mL 水时，温度变化引起量筒取样体积变化为 ±0.14175mL ，即区间半宽度 a=0.14175 ；移液枪吸取 9mL 生理盐水和 1mL 样品匀液时，温度变化引起取样体积变化分别为 ±0.00567mL 、 ±0.00063mL ，即区间半宽度a分别为0.00567和 0.000 63 。按照矩形分布 ，温度变化引入的相对标准不确定度分别为

因此，量筒、 10mL 移液枪和 1mL 移液枪引入的相对标准不确定度分别为

综上所述，由稀释过程引人的相对标准不确定度为

2.1.3 加样引入的B类不确定度

实验中加样体积为 1mL ，此过程只用考虑由1mL 移液枪引入的不确定度，使用的移液枪与2.1.2使用的 1mL 移液枪为同一把，因此由加样引入的相对不确定度为 u_rel（ 加样 ）=u_rel（V₁）=0.002910 0

2.2A类不确定度评定

A类不确定度主要是由重复性检测引入。由于微生物间存在互生、共生和拮抗等复杂关系[]，检测结果分散，因此直接基于平均值计算标准偏差的方法并不合理，通常采用对数转换后结合贝塞尔公式进行计算。本实验中，由同一技术人员对20份样品进行重复检测，以提高自由度，具体结果见表1。

通过计算20个试样的合并样本标准差，得到