高效液相色谱法测定食品中4-己基间苯二酚残留量的方法验证

摘 要：目的：验证沈阳市食品药品检验所实验室是否有开展《食品安全国家标准 食品中4-己基间苯二酚残留量的测定》（GB 5009.280—2020）项目的检验能力。方法：采用高效液相色谱进行分离，荧光检测器进行检测分析，根据保留时间进行定性分析，外标法进行准确定量，同时验证方法标准曲线线性范围、检出限、定量限、精密度和回收率。结果：当4-己基间苯二酚浓度在0.02～2.00 mg·L-1时，呈现出的线性关系良好，方法检出限、定量限、精密度和回收率均能满足国家标准方法要求。结论：沈阳市食品药品检验所实验室有能力进行食品中4-己基间苯二酚残留量的测定。

关键词：高效液相色谱；食品；4-己基间苯二酚；方法验证

Validation of Method for Determination of 4-Hexylresorcinol Residues in Food by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yun1， LI Qiaolian1， LIN Yang1， YU Jiaozhu1， JU Xiaoying1， DANG Hui2

（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute， Shenyang 110122， China; 2.Liaoning Open University， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： To verify whether the laboratory of Shenyang Institute for Food and Drug Control has the ability to carry out the GB 5009.280—2020 project. Method： High performance liquid chromatography was used for separation， fluorescence detector was used for detection and analysis， qualitative analysis was carried out according to the retention time， and external standard method was used for accurate quantification. At the same time， the linear range， detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the standard curve of the method were verified.Result： When the concentration of 4-hexylresorcinol is in the range of 0.02～2.00 mg·L-1， the linear relationship is good. The detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the method can meet the requirements of national standard method. Conclusion： The laboratory of Shenyang Food and Drug Inspection Institute has the ability to determine the residual amount of 4-hexylresorcinol in food.

Keywords： high performance liquid chromatography; food; 4-hexylresorcinol; method verification

4-己基间苯二酚是一种新型抗氧化剂，能够抑制褐变，其本身为黄白色、白色针状结晶，如遇空气、光则变成淡棕粉红色，有强涩味，弱臭，可使舌头产生麻木感，微溶于甲醇、植物油、乙醇、氯仿、水及苯等物质[1-3]。4-己基间苯二酚是一种水产品类的加工助剂，能够有效抑制虾类产品机体中的多酚氧化酶的活性，可在贮存过程中保持蟹类、虾类等甲壳水产品不产生褐变，色泽较好[4-6]。原国家卫生和计划生育委员会于2014年12月24日发布的《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定，4-己基间苯二酚为我国合法的食品添加剂，可作为抗氧化剂应用在虾类鲜水产的食品中，要求按生产需要适量使用，食品中残留量应≤1 mg·kg-1。

在国民经济快速发展的时代，人们对健康更加重视，对水产品的营养成分、口感、鲜嫩程度要求越来越高。因此，4-己基间苯二酚作为一种可应用于虾类鲜水产中的抗氧化剂备受关注[7-9]。目前，食品中4-己基间苯二酚残留量的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法以及气相色谱-质谱法[10]。采用高效液相色谱分离，荧光检测器检测的方法可准确快速地对4-己基间苯二酚进行定性定量分析，此方法已被广泛应用于鲜水产虾和螃蟹中4-己基间苯二酚残留量的测定中。

本文根据实验室资质认定的相关要求，在使用检验方法前对食品中4-己基间苯二酚残留量进行方法验证，从而保证本实验室的环境条件、仪器设备、人员能力和试剂耗材能够满足《食品安全国家标准 食品中4-己基间苯二酚残留量的测定》

（GB 5009.280—2020）方法的要求。本次验证的内容主要包括标准品、仪器设备、试剂耗材等是否满足要求，方法检出限、定量限、标准曲线线性范围、精密度和回收率是否满足相关标准的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾：市售；乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；乙酸乙酯：色谱纯，国药集团；正己烷：色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；无水硫酸钠：分析纯，天津市博迪化工有限公司；实验用水：均为GB/T 6682—2008规定的超纯水；4-己基间苯二酚标准物质：纯度为98.8%，First standard。

1.2 主要设备和仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，配2475FlR检测器，美国Waters公司；QUINTIX213-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-250DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DMV-16多试管涡旋混合器，广东省科寅公司；H1750R医用离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取代表性样品的可食部分约500 g，经组织捣碎机粉碎混匀后，装入洁净的容器中作为试样，密封并做好标识，试样于-18 ℃保存。

1.3.2 样品前处理

（1）提取。准确称取2.00 g制备好的样品于

50 mL离心管中，加入乙酸乙酯20 mL，无水硫酸钠3 g，均质30 s，然后离心3 min，将上清液全部转移到100 mL浓缩瓶中，在剩余的残渣中加入20 mL乙酸乙酯，重复上述流程，进行均质，离心，合并两次上清液于同一个浓缩瓶之中，在35 ℃水浴中蒸发至近干。

（2）净化。在提取好的残渣中加入2 mL甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液进行复溶，然后进行10 s超声、30 s涡旋，使残渣全部溶解，再加入乙腈饱和正己烷溶液2 mL，涡旋后转移至离心管中，离心3 min，弃去正己烷层后，再次向离心管中加入2 mL乙腈饱和正己烷溶液，先进行30 s涡旋，然后离心，弃去上层正己烷，吸取下层溶液经0.45 μm有机膜过滤后待测。

1.3.3 绘制标准曲线

标准储备液（100 mg·L-1）：称取10 mg（精确到0.01 mg）4-己基间苯二酚标准物质，置于100 mL容量瓶中，使用甲醇进行溶解，然后定容至刻度线，混合均匀。

标准中间液（10 mg·L-1）：吸取1.00 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇进行稀释、定容。

标准系列工作液：分别吸取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL标准中间液，置于10 mL容量瓶中，用甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液定容至10 mL，得到浓度分别为0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1及2.00 mg·L-1的标准系列工作液。

1.3.4 仪器条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水=65∶35（体积比）；进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：激发波长280 nm，发射波长310 nm。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及其相关要求

按照标准的仪器条件将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中进行测试分析，4-己基间苯二酚标准溶液的液相色谱图如图1所示。由图1可知，采用反相液相色谱-荧光检测器测定4-己基间苯二酚，所得色谱峰两边对称，无拖尾，不分叉，较为理想。

4-己基间苯二酚标准系列工作液得到的标准校正曲线如图2所示。由图2可知，4-己基间苯二酚标准校正曲线线性方程为Y=1.85×106X-9.46×103，相关系数R2=0.999 136，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求（R2≥0.99）。因此，当4-己基间苯二酚浓度为0.20～2.00 mg·L-1时，线性关系良好。

2.2 方法检出限

根据国家标准《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法评估LOD”的方法对方法检出限进行测定，以检出限（0.020 0 mg·kg-1）水平进行加标实验，10次平行测定结果分别为0.021 0 mg·kg-1、0.024 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.022 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.021 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1及0.024 0 mg·kg-1，平均值为0.023 0 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于3。

2.3 方法定量限

根据国家标准《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法评估LOD”的方法对方法定量限进行测定，以定量限（0.050 0 mg·kg-1）水平进行加标实验，10次平行测定结果分别为0.052 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.052 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1及0.051 0 mg·kg-1，平均值为0.051 3 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于10。

2.4 精密度

根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求，选取一种阳性样品进行3水平6平行精密度试验。本研究选取选取低（0.050 0 mg·kg-1）、中（0.100 0 mg·kg-1）、高（0.500 0 mg·kg-1）3种浓度的样品分别进行6次平行试验。低、中、高三水平下的精密度分别为1.02%、2.88%、1.15%，均满足GB/T 27404—2008对于精密度的要求。