高效液相色谱法测定花生中β-谷甾醇的含量
作者: 闫超杰 章程 张旭东 王诗琦 孙晓东
摘 要:目的:建立超声波辅助萃取-高效液相色谱法快速检测花生中β-谷甾醇的分析方法,并应用该方法对辽宁、山东和河南3个花生种植大省不同品种花生中β-谷甾醇的含量进行分析测定。方法:样品经85%乙醇溶液(乙醇∶水=85∶15,V∶V)超声提取,离心,中性氧化铝去色素和杂质后,经Agilient ZORBAX SB-C18色谱柱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量。结果:β-谷甾醇在1.0~100.0 mg·L-1范围内与峰面积线性关系良好,回归方程为y=10.070x+2.348(r=0.999 9);平均加标回收率为88.5%~106.9%,相对标准偏差为2.31%~4.73%(n=6),检出限为0.5 mg/100 g。运用该方法对30个花生样品进行检测,不同品种花生β-谷甾醇含量在31.6~77.0 mg/100 g。结论:该方法简单快捷、重复性好、准确度和灵敏度较高,适用于花生中β-谷甾醇的快速检测。
关键词:花生;β-谷甾醇;超声波辅助萃取;高效液相色谱法(HPLC)
Determination of β-Sitosterol in Peanuts by High Performance Liquid Chromatography
YAN Chaojie1, ZHANG Cheng1, ZHANG Xudong1, WANG Shiqi1, SUN Xiaodong2*
(1.Comprehensive Technical Service Center of Jinzhou Customs, Jinzhou 121013, China; 2.College of Environment and Bioresources, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China)
Abstract: Objective: To establish a rapid analytical method for the determination of β-sitosterol in peanuts by ultrasonic-assisted extraction-high performance liquid chromatography (HPLC).The method was applied to determine the contents of β-sitosterol in different peanut varieties from Liaoning, Shandong and Henan province. Method: The samples were extracted with 85% ethanol (ethanol∶water=85∶15, V∶V) by ultrasonic, after centrifugation and removing pigments and impurities with neutral alumina, separated by Agilient ZORBAX SB-C18 column, and then detected by diode array detector, and quantitated by external standard method. Result: β-sitosterol showed a good linear relationship with peak area in the range of 1.0~100.0 mg·L-1, and the regression equation was y=10.070x+2.348 (r=0.999 9). The average recoveries were 88.5%~106.9%, with RSD of 2.31%~4.73%, and the limit of detection was 0.5 mg/100 g. The method was used to detect 30 peanut samples, the content of the content of β-sitosterol in different peanuts ranged from 31.6 mg/100 g to 77.0 mg/100 g. Conclusion: The method has the advantages of simple, convenient, good repeatability, high accuracy and sensitivity, which can meet the requirements of rapid analysis of β-sitosterol in peanuts.
Keywords: peanut; β-sitosterol; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography (HPLC)
花生是我国重要的油料和经济作物[1],目前我国花生种植面积排全球第二位,年总产量居世界首位[2-3]。在我国,花生常被人们称为长寿果,其不仅是一种具有很高营养价值的食品,也是一味可以入药的保健良品。花生中除了含有人体所必需的油酸、亚油酸等多种脂肪酸及亮氨酸、色氨酸等氨基酸外[4],还含有丰富的维生素、微量元素、糖类、多酚类、胆碱、膳食纤维和植物甾醇等营养成分[5-6],其中植物甾醇为食品中公认的抗癌抗肿瘤营养成分。花生中含有的植物甾醇以β-谷甾醇含量最高,已有研究证明β-谷甾醇在降低血液胆固醇含量、抑制乳腺增生、抑制肿瘤、防治前列腺增生和调节免疫方面都有重要作用[7-9]。2004年欧盟就已经批准允许在特定食品中使用植物甾醇,2010年我国原卫生部也批准并认证植物甾醇为新资源食品[10],由此可见β-谷甾醇具有很高的应用价值。因此,花生作为β-谷甾醇含量较高的经济作物种类,应在高甾醇品种培育和深加工提取方面予以重点关注、研究和推广。
目前,现已报道的用液相色谱法检测花生中β-谷甾醇的样品前处理方法普遍较为复杂。例如,张建书等[11]用高效液相色谱法对山东、广东、河南3个地区共45个花生品种中植物甾醇的组成及含量进行分析测定时,采用正己烷浸提萃取花生油,再对花生油皂化回流进行植物甾醇提取;张志舟等[12]用反向高效液相色谱法测定花生中β-谷甾醇时,采取花生样品先皂化回流,再用正己烷液液萃取,最后再进行过滤和定容。以上前处理方法中,花生样品需要经过浸提、皂化、萃取、过滤和定容等多个环节才能进行液相色谱上机检测,相对费时费力,整个过程消耗的有机试剂量较大,也会导致分析物的回收率相对较低。因此,本研究建立了超声波辅助提取,结合高效液相色谱法检测花生中β-谷甾醇含量的方法,拟为我国筛选富含β-谷甾醇的花生品种提供技术支持,也为快速检测花生中β-谷甾醇含量提供方法依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生样品由锦州海关综合技术服务中心收集,供试的30个花生样品(编号为P1~P30)来自辽宁、河南、山东3个省份。所有花生样品均产于2022年。
β-谷甾醇标准品(纯度≥98.9%,上海安谱实验科技股份有限公司);乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)、中性氧化铝(分析纯,天津市光复精细化工研究所);甲醇、乙腈(色谱纯,美国J.T.Baker公司)。
1.2 仪器与设备
Agilent 1100型高效液相色谱仪带二极管阵列检测器、ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(美国安捷伦公司);B-400粉碎机(德国BUCHI公司);BS 323 S千分之一天平、BSA 224 S万分之一天平(德国赛多利斯公司);KH7200DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);T 25均质分散器、MS 3 digital旋涡混合器(德国IKA公司);3-15台式大容量离心机(德国Sigma公司);0.22 μm有机系滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 花生中β-谷甾醇的提取
将收集的花生样品,去壳,选取成熟饱满、大小均一、无腐败损伤的花生仁用高速粉碎机粉碎。称取花生粉末5 g(精确至0.001 g)于100 mL具塞聚乙烯离心管中,加入30 mL 85%乙醇溶液,用均质分散器(转速18 000 r·min-1)均质100 s后,放于25 ℃水浴中超声30 min;4 000 r·min-1离心5 min,将上清液倒入另一个干净离心管中,再以少量85%乙醇溶液洗涤残渣,4 000 r·min-1 离心5 min后合并滤液,并向滤液中加入5 g中性氧化铝,混匀振荡2 min后,4 000 r·min-1离心5 min,将上清液转移至50 mL具塞玻璃管中定容,用微量移液器取1 mL过0.22 μm滤膜后进行高效液相色谱检测分析。如提取后的样品不能及时上机检测,需要放到4 ℃条件下避光冷藏保存。
1.3.2 标准溶液的配制
(1)β-谷甾醇标准储备液。精密称取β-谷甾醇标准品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中,加入无水乙醇溶解并定容,配制成1 000 mg·L-1的标准储备液,-20 ℃避光保存,有效期2个月。
(2)β-谷甾醇标准工作液。用无水乙醇将
1 000 mg·L-1 β-谷甾醇标准储备液稀释成浓度分别为1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的标准工作液,4 ℃避光冷藏备用。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱为ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇∶乙腈(40∶60,V∶V);流速为1.0 mL·min-1;检测波长设定为210 nm;柱温箱温度为30 ℃;样品进样量为30 μL。
1.3.4 测定
取30 μL样品溶液进行高效液相色谱测定,在上述色谱条件下测定试样中β-谷甾醇的峰面积。由标准工作曲线的线性回归方程计算花生样品溶液中β-谷甾醇的浓度。
1.3.5 结果计算
花生样品中β-谷甾醇含量的计算公式为
式中:X为样品中β-谷甾醇的含量,mg/100 g;ρ为花生样品溶液中β-谷甾醇的浓度,mg·L-1;V为试样最终定容体积,mL;m为样品质量,g。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的选择
目前,食品和药物中β-谷甾醇检测的前处理方法主要有皂化回流提取法、萃取提取法、超声波辅助萃取法、吸附法和络合法等[13-14],但大多数前处理方法的提取过程都比较烦琐、步骤繁多。同时,由于植物甾醇通常存在于复杂的植物基质中,样品溶液中有多种潜在干扰物,花生中蛋白质和脂肪含量又较高,所以本研究既要缩短前处理时间,简化操作步骤,还要去除提取溶液中的干扰成分,最终选用提取效率较高同时又操作简便的超声波辅助提取法。从图1中可以看出均质后的花生样品经过超声波提取再高速离心,加入中性氧化铝可以去除样品溶液中的大量色素和部分杂质,不仅在花生样品的提取溶液中保留了β-谷甾醇成分,还可以防止基质中蛋白质和脂肪等成分的干扰。实验结果表明,应用超声波-离心前处理法提取效率高,速度快,适用于花生中β-谷甾醇的快速提取检测。
2.2 流动相的选择
高效液相色谱法检测β-谷甾醇常用的流动相有乙腈[11]、乙腈/异丙醇[12]、甲醇[15-16]、甲醇/水[17-18]、甲醇/0.1%磷酸[19]、甲醇/0.15%甲酸[20]等。本研究分别采用色谱实验室常用的100%甲醇、甲醇/水和甲醇/乙腈体系分离花生样品提取溶液中的β-谷甾醇。其中以100%甲醇为流动相时,β-谷甾醇出峰时间较早,保留时间在7 min左右,但分离度较低,使β-谷甾醇的色谱峰与后面紧邻的其他植物甾醇色谱峰基线不能实现有效分离;以不同比例的甲醇/水为流动相时,β-谷甾醇色谱峰的峰形不佳。最终采用甲醇∶乙腈=40∶60为流动相时,β-谷甾醇色谱峰的峰形较好,分离度能够到达检测需求,出峰时间也较适宜。这是由于反相色谱柱中溶剂的洗脱能力随样品极性的增强而减弱,甲醇的极性强于乙腈,故在流动相中加入洗脱能力更强的乙腈更有利于β-谷甾醇的分离。