食品微生物检测中分子诊断技术的优化
作者: 马亚飞摘 要:随着现代食品工业的快速发展,食品安全问题得到社会的广泛关注。食品中微生物污染是影响食品安全的主要因素之一,因此对食品中微生物的检测十分重要。近年来,随着分子生物学的发展,以聚合酶链式反应、核酸杂交、基因芯片等为代表的分子诊断技术逐渐应用于食品微生物检测领域。本文在介绍食品微生物检测中常用分子诊断技术的基础上,总结出分子诊断技术应用中存在的问题,并针对性地提出优化分子诊断技术的建议,以期为进一步提升食品微生物检测水平提供参考。
关键词:食品微生物检测;分子诊断技术;优化建议
Optimization of Molecular Diagnostic Techniques in the Detection of Food Microorganisms
MA Yafei
(Ye County Food Inspection and Testing Center, Pingdingshan 467200, China)
Abstract: With the rapid development of modern food industry, food safety has received widespread attention from the society. Microbial contamination in food is one of the main factors threatening food safety, so the detection of microorganisms in food is very important. In recent years, with the vigorous development of molecular biology, molecular diagnostic technologies represented by polymerase chain reaction, nucleic acid hybridization and gene chip have been gradually applied in the field of food microbial detection. In this paper, on the basis of introducing the commonly used molecular diagnostic technologies in food microbial detection, the problems in the application of molecular diagnosis technology are summarized, and some suggestions to optimize the molecular diagnosis technology are put forward, in order to provide reference for further improving the level of food microbial detection.
Keywords: food microbial detection; molecular diagnostic technology; optimization suggestions
食品安全关乎着人们的健康和社会稳定。食品中的微生物污染是导致食源性疾病的主要原因,及时准确地检测食品中的致病微生物,对保障食品安全、控制食源性疾病的发生与流行具有重要作用[1]。传统的食品微生物检测方法主要依赖于微生物的培养和生化反应,存在检测周期长、灵敏度低等缺点,难以满足现代食品安全监管的需求。近年来,随着分子生物学的发展,一系列分子诊断技术如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、荧光定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、核酸杂交、基因芯片等被引入食品微生物检测领域。这些技术不依赖于微生物培养,可直接从食品基质中提取核酸进行检测,大大缩短了检测周期,提高了检测灵敏度和特异性。但在分子诊断技术的实际应用中,仍存在不少障碍和误区,限制了其性能的充分发挥[2]。
1 食品微生物检测中的常用分子诊断技术
1.1 聚合酶链式反应
PCR技术凭借其操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,已成为食品微生物检测领域的常用分子诊断方法。PCR技术是指利用一对特异性引物,在DNA聚合酶的作用下,通过连续的变温过程实现目标DNA片段的指数扩增。这一方法有效弥补了传统微生物培养技术检测周期长、灵敏度低等缺陷,提高了食品致病菌的检出效率。
然而,传统PCR技术仍存在一些不足之处。①PCR仅能对目标微生物进行定性检测,无法准确反映食品中微生物的含量水平。②PCR对反应条件高度敏感,易受外源DNA等因素的干扰而出现假阳性结果。针对上述局限,研究者开发了多种PCR衍生技术,如荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等,进一步拓展了PCR技术的应用范围和灵活性[3]。
1.2 荧光定量PCR
qPCR是在传统PCR技术基础上进一步发展的新一代分子诊断技术。qPCR引入荧光标记物,可在扩增过程中实时监测每个循环的荧光信号变化,据此估算出样品中目标微生物的起始含量。与传统PCR技术相比,qPCR技术最大的优势在于实现了病原菌的绝对定量或相对定量,为精准评估食品微生物污染状况提供了重要的技术手段。
目前,qPCR已被广泛应用于食品中多种致病菌的高通量筛查和含量分析。例如,研究者利用qPCR技术对速冻水饺、生鲜乳等样品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行了快速定量检测,灵敏度在10~102 CFU·g-1(CFU·mL-1)[4]。这些结果表明,qPCR技术有望成为食品微生物检测的“金标准”,但qPCR对实验操作和环境条件要求较高,所以应注意规范化操作,提高检测的精密度和准确度。
1.3 核酸杂交
核酸杂交技术是基于核酸分子间特异性碱基配对原理而建立的另一类重要的分子诊断方法。该方法以人工合成的核酸探针为杂交试剂,与样品中的目标序列进行互补配对,再通过检测杂交复合物的信号强度判断目标微生物的存在情况及含量。斑点杂交、Southern 杂交、原位杂交等是目前应用较为成熟的核酸杂交技术。
核酸杂交具有操作相对简便、重复性好,无须对微生物进行复杂培养等优点,在食品致病菌快速筛查方面有其独特的优势。但传统核酸杂交仪器依赖放射性同位素标记,存在污染环境、危害人体健康等风险。此外,核酸杂交的灵敏度相对较低,在复杂食品基质中容易出现漏检问题。为解决上述问题,研究者开发了多种新型核酸探针,如肽核酸(Peptide Nucleic Acids,PNA)探针、量子点标记探针等,明显提高了核酸杂交检测食源性病原菌的灵敏度和特异性。
1.4 基因芯片
基因芯片是继PCR和核酸杂交之后新一代高通量分子诊断技术。基因芯片可在一张芯片上整合成百上千个探针,实现对多种微生物的同时分析。根据芯片类型和用途,基因芯片可分为基因表达芯片、基因分型芯片、比较基因组杂交芯片等不同形式。基因芯片技术的发展,为实现食品微生物的多菌种同检和溯源分析奠定了基础。基因芯片检测通量高、特异性强,可以对多个食品样品进行并行分析,大大提高了检测效率。研究表明,16S核糖体RNA基因(16S ribosomal DNA,16S rDNA)芯片可实现6种食源性致病菌的同时定性定量检测,灵敏度可达103 CFU·mL-1,具有良好的应用前景[5]。但基因芯片仪器和试剂价格昂贵,数据分析流程复杂,一定程度上限制了其在食品检测领域的推广。
2 分子诊断技术在食品微生物检测应用中存在的问题
2.1 样品处理方法不当
样品处理是食品微生物分子检测的关键环节,直接影响后续核酸提取和扩增效率。然而,食品基质成分复杂多样,含有多种PCR抑制物质,如脂肪、蛋白质、多糖等。若这些抑制物质未能有效去除,会极大干扰核酸提取过程,导致提取效率低下,甚至出现假阴性结果。此外,不同的食品基质中抑制物质的种类和含量存在较大差异,若采用统一的样品处理方法,很难满足不同基质的需求。样品处理方案的选择和优化对食品微生物核酸提取效果有一定影响。例如,市售DNA提取试剂盒虽然操作简便,但针对某些复杂基质(如发酵乳制品)缺乏专一性,导致提取效果不佳。若样品处理不当,PCR检测灵敏度可能会降低1~2个数量级,甚至完全检测不到目标菌[6]。
2.2 引物/探针设计缺乏特异性
引物和探针是PCR和核酸杂交反应的核心组分,其设计的科学性和特异性直接关系到分子检测的灵敏度和准确性。理想的引物和探针应具有以下特点。①特异性强,只与目标基因结合,不与其他非特异性序列杂交。②引物间不能形成二聚体,避免竞争性扩增。③引物和模板间不能形成稳定的发夹结构,影响扩增效率。然而,在实际引物/探针设计中,很难同时满足以上特点,从而影响了分子检测的特异性和重复性。宽谱引物虽然可同时检测多个菌种,但特异性差,容易扩增出目标菌以外的条带,影响检出结果的准确性。引物自身二级结构如发夹、自身互补等会降低有效引物的浓度。探针与引物间的不合理设计也会产生干扰信号,影响杂交效率。
2.3 扩增条件未优化
PCR反应对扩增条件高度敏感,退火温度、延伸时间、镁离子浓度等因素的微小变化都会影响扩增效率和特异性。当退火温度过低时,引物易发生非特异性结合,产生额外条带;退火温度过高则会降低引物结合效率,减少目标产物的生成量。镁离子浓度过低会抑制DNA聚合酶活性,过高则易产生非特异性扩增。延伸时间不足,长片段模板来不及完全扩增;延伸时间过长,非特异性产物会大量积累。以上问题表明,单纯依赖于经验设置PCR参数,很难达到最佳扩增效果。而许多研究者却忽视了食品基质复杂性对扩增条件的影响,盲目照搬文献中的反应体系,从而影响检测的灵敏度和特异性。
2.4 缺乏必要的阳性对照和阴性对照
阳性和阴性对照是保证分子诊断结果可靠的重要步骤。在食品微生物核酸检测中,阳性对照主要用于排除假阴性,评估扩增反应的有效性;而阴性对照则用于监控污染,识别假阳性信号。在理想情况下,每批次检测都应设置阳性和阴性对照,并全程监控检测过程。然而,在实际工作中,阳性/阴性对照会出现缺失现象,这是导致分子检测失误的重要原因之一。导致这一问题的原因是多方面的。①某些实验室受限于成本和操作难度等因素,未使用标准菌株和质控品,因此缺乏可靠的阳性对照来源。②在核酸提取环节,内参基因是核酸提取和PCR反应的有效性指标,然而很多检测方案并未涵盖内参对照,无法及时发现核酸提取失败或PCR抑制等问题。③在扩增环节,交叉污染是导致假阳性的常见原因,但由于阴性对照的缺失,这些污染问题很难被及时发现和追溯[7]。
3 食品微生物检测中分子诊断技术使用质量的优化建议
3.1 优化食品样品前处理方案
针对食品基质的复杂性,可从以下方面优化样品前处理。在物理处理方面,研究者尝试了机械匀浆、高压匀浆、超声波处理等方法,以提高微生物裂解效率。化学裂解剂如溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化铵等的使用,可有效去除细胞蛋白和多糖等干扰物质。此外,一些吸附材料如聚乙烯亚胺、氧化铝、二氧化硅颗粒等可用于吸附食品中的PCR抑制物。
3.2 加强引物和探针的优化设计
应用生物信息学,可从多方面优化引物和探针设计。在序列选择方面,引物和探针设计区域应具有物种特异性,避开易发生突变的位点。利用同源性分析和多序列比对等工具,可筛选出特异性强、突变率低的候选区域。针对候选序列,可用Primer Premier、Oligo等软件进行二级结构和热力学性质预测,选择自由能低、发夹和自身互补少的最优引物。同时,可采用退火温度标记引物、锁核酸修饰探针等新型策略提高检测的特异性。