超高效液相色谱-质谱联用法测定保健食品中的米罗那非和庆地那非

摘 要：建立超高效液相色谱-质谱联用法测定缓解疲劳保健食品中非法添加米罗那非、庆地那非含量的检测方法。在电喷雾离子源正模式多反应监测方式下，以米罗那非定量/定性子离子对99.1/296.1，庆地那非定量/定性子离子对285.2/327.1为目标监测离子，空白基质外标法定量。结果：空白基质无干扰；米罗那非、庆地那非在10～1 000 ng·mL-1线性关系良好，相关系数分别为0.999 7和0.999 3；米罗那非的方法精密度为1.5%，平均回收率为90.4%～97.9%，相对标准偏差为0.9%～1.8%；庆地那非的方法精密度为1.2%，平均回收率为89.4%～96.6%，相对标准偏差为0.6%～2.4%；两者方法检出限、定量限分别为50 µg·kg-1和100 µg·kg-1。本文所建立的方法专属性强、准确、灵敏，可作为缓解疲劳类保健食品中非法添加米罗那非、庆地那非的痕量分析方法。

关键词：米罗那非；庆地那非；超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）；保健食品；非法添加

Determination of Mirodenafil and Gendenafil in the Heathy Food by UPLC-MS

WANG Fengqin1， ZHANG Huaiguang1， ZHANG Qiuyan2， LI Zihua1

（1.Fuyang Inspection and Testing Center， Fuyang 236111， China; 2.School of Biological and Food Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China）

Abstract： To establish a method for determination of mirodenafil and gendenafil illegally added in the relieve fatigue heathy food by UPLC-MS. Mirodenafil quantitive product ion 99.1 and qualitative product ion 296.1， gendenafil quantitive product ion 285.2 and qualitative product ion 327.1 were detected as target ions under the positive mode multiple reaction monitoring， and quantitative analysis used blank matrix external standard method. The results indicated that the blank matrix solution had no interference. Milonafil and gendenafil had a good linear relationship within the range of 10～1 000 ng·mL-1， with a correlation coefficient of 0.999 7 and 0.999 3， respectively. The precision of the method for mironafine is 1.5%， average recovery rates were from 90.4% to 97.9%， and the relative standard deviation were between 0.9% to 1.8% . The precision of the method for gendenafil is 1.2%， average recovery rates were between 89.4% to 96.6%， with relative standard deviation of 0.6% to 2.4%. The method detection limit and quantification limit are 50 µg·kg-1 and 100 µg·kg-1， respectively. The method is high specificity， accurate and sensitive， can be used as a trace analysis method for illegally adding mirodenafil and gendenafil in fatigue relieving health foods.

Keywords： mirodenafil; gendenafil; ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS）; heathy food; illegally added

保健食品是一类具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的，具有调节机体功能，并且对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害的食品[1]。随着人们生活水平的提高，健康养生逐渐成为追求品质生活的新风尚，保健食品的市场需求不断增长。为保障人们的健康，我国针对保健食品颁布了一系列法规及标准。近年来，随着人们生活节奏的加快，缓解疲劳类保健食品成为众多肾虚、易疲劳人群青睐的消费品；一些不法分子将具有壮阳功能的5型磷酸二酯酶抑制剂添加到缓解疲劳类保健食品中，从中非法牟利[2-7]。

5型磷酸二酯酶抑制剂在临床上对用药品种和剂量有严格的要求，多用于治疗男性勃起功能障碍，若服用硝酸酯类的心脏病患者和服用α受体阻滞剂的人群误服，易出现低血压甚至昏厥等症状[8-9]。消费者在不知情的情况下，长期摄入含有非法添加

5型磷酸二酯酶抑制剂的保健食品，可能会出现心率加快、血压升高、消化不良和视力损伤等毒副作用，甚至危及生命安全[10]。目前已发现90多种5型磷酸二酯酶抑制剂及衍生物，我国批准上市的有枸橼酸西地那非、枸橼酸爱地那非、他达拉非、盐酸伐地那非和阿伐那非，这些已批准上市的5型磷酸二酯酶抑制剂有其相应的检验方法[11-14]。但在保健食品中添加现行检测方法范围外又具有壮阳功能的新型

5型磷酸二酯酶抑制剂及其衍生物成为非法牟利的手段[15-17]，这些抑制剂并无药理和毒理活性数据的论证，势必会威胁公众健康，因此开展缓解疲劳类保健食品中新型那非类衍生物检验方法的研究迫在眉睫。

米罗那非作为第二代5型磷酸二酯酶抑制剂于2007年出现在韩国，庆地那非药理作用尚不明确，两者在我国均未批准上市，因此国内对这两种新型那非类衍生物的检验方法鲜有报道[18]。本文采用超高效液相色谱-质谱联用技术，建立了以米罗那非、庆地那非为非法添加目标物质的测定方法，以期为缓解疲劳类保健食品违法添加的日常监管工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂

样品来源：行刑衔接委托检验样品，剂型为片剂和胶囊；米罗那非（批号：G23110476，99.3%，墨坛质检）；甲醇中庆地那非标准溶液（批号：S086421，100 µg· mL-1，99.6%，阿尔塔）；甲醇、乙腈（色谱纯，迪马科技公司）；甲酸（色谱纯，阿拉丁，≥98%）；分析用水均为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器

1290-6460 QQQ三重四极杆质谱仪，安捷伦公司；ME XPR36/A梅特勒-托利多电子天平（百万分之一），瑞士METTLER TOLEDO公司；ATY224岛津电子天平（万分之一），日本岛津；Elma EASY300H超声波清洗器，德国Elma公司；IKA A11粉碎机，德国IKA公司。

1.3 标准溶液的配制

精密称取米罗那非2.518 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，折算纯度后配制成100 µg·mL-1单标储备液；甲醇中庆地那非标准溶液浓度为100 µg·mL-1；用甲醇逐级稀释制成米罗那非、庆地那非各自浓度为10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的系列混标溶液。

1.4 供试品溶液的配制

片剂粉碎备用，胶囊剂内容物研细混匀备用。精密称取样品1 g（精确至0.000 1 g），溶解后置于50 mL容量瓶中，加适量甲醇，旋涡振荡2 min，超声提取15 min，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，上清液过0.22 µm有机微孔滤膜，定性分析可以直接上机，定量分析需要参照定性分析响应值结果稀释至定量线性范围内测试。

1.5 仪器条件优化

1.5.1 色谱条件分析

（1）流动相优化。实验以甲醇-0.1%甲酸体系和乙腈-0.1%甲酸体系为考察对象，按照表1所示的梯度洗脱条件，流速0.2 mL·min-1，测定米罗那非、庆地那非各自浓度为100 ng·mL-1的混标溶液，比较两种物质的信噪比与峰面积。

（2）流速的优化。以乙腈-0.1%甲酸为流动相体系，考察不同流速（0.2 mL·min-1、0.3 mL·min-1）对物质信噪比及峰面积的影响。

1.5.2 质谱条件优化

以米罗那非（500 ng·mL-1）和庆地那非（500 ng·mL-1）的混标溶液作为测试液，采用正离子模式，添加挥发性的甲酸考察离子化效率。

1.6 仪器条件

1.6.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 µm）；进样体积：5 µL；柱温35 ℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，流量为0.2 mL· min-1，梯度洗脱，程序见表1。

1.6.2 质谱条件

电喷雾离子源正模式；多反应监测扫描（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；电离电压：3 500 V；干燥气流量：7 L·min-1；干燥气温度：325 ℃；鞘气流量：11 L·min-1；鞘气温度：350 ℃；雾化气流量：40 psi。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 色谱条件分析

（1）流动相选择。由图1（a）、图1（b）可知，采用甲醇-0.1%甲酸体系，米罗那非、庆地那非无法洗脱出来；而乙腈-0.1%甲酸体系可以很好地将两种物质洗脱出来，米罗那非信噪比为857.4倍、庆地那非信噪比为734.4倍；两者定量子离子峰面积响应值分别为5 403和4 919，表明采用乙腈-0.1%甲酸体系优于甲醇-0.1%甲酸体系。

（2）流速优化。由图1（b）、图1（c）可知，当流速为0.2 mL·min-1时，米罗那非、庆地那非信噪比分别为857.4倍和734.4倍；均高于0.3 mL·min-1流速下两种物质分别对应的信噪比（166.0倍和441.5倍）。当流速为0.2 mL·min-1时，米罗那非定量子离子峰面积为5 403，是0.3 mL·min-1流速下峰面积

2 010的2.6倍；庆地那非在两种流速下峰面积差异不大。因低流速可降低柱压，起到延长色谱柱寿命的作用，故综合以上优化实验，采用乙腈-0.1%甲酸流动相体系（0.2 mL·min-1）梯度洗脱作为液相色谱的洗脱条件。

2.1.2 质谱条件优化

先进行离子全扫描确定母离子，再进行选择离子监测确定最优裂解电压，最后进行子离子扫描优化最佳碰撞能，最终确定多重反应监测的采集条件如表2所示。米罗那非定量、定性子离子m/z分别为99.1和296.1，庆地那非定量、定性子离子m/z分别为285.2和327.1，这与补充检验方法BJS201805所述不同（BJS201805中米罗那非定量、定性离子m/z分别为296.1和99.1，庆地那非定量、定性离子m/z分别为327.1和285），在质谱分析中，可根据实际情况，选择响应信号强且无干扰的离子对进行检测，质谱参数亦可根据实际可达到最优灵敏度的条件进行设定[19]。