食品中常用益生菌的检测和鉴定技术研究进展

摘 要：随着益生菌和人体共生关系研究的深入，菌种的快速发现、分离和筛选，以及益生菌产品质量的高效管控都有赖于检测及鉴定技术的进步。本文综述了表型、基因型等鉴定技术以及常用的定量检测技术的研究进展。近年来，研究者们逐步将多种检测技术结合应用，提供多维度的检测方案，并进行相互验证，推动了检测技术向系统化、精准化、高效化以及低成本化的方向发展。本文为益生菌的日常检测研究提供了参考和借鉴。

关键词：益生菌；鉴定；定量检测

Research Progress on Detection and Identification Technology of Commonly Used Probiotics in Food

Abstract： With the deepening of research on the symbiotic relationship between probiotics and the human body， the rapid discovery， isolation and screening of bacterial species， as well as the efficient control of the quality of probiotic products， all rely on the progress of detection and identification technologies. This article reviews the research progress of phenotypic and genotypic identification technologies and commonly used quantitative detection technologies. In recent years， researchers have gradually combined and applied a variety of detection technologies， provided multi-dimensional detection schemes， and conducted mutual verification， which has promoted the development of detection technology towards systematization， precision， efficiency and low cost. This article provides a reference for the daily detection research of probiotics.

Keywords： probiotic; identification; quantitative detection

1 益生菌的研究现状

益生菌是对人体有益的微生物群体，能够通过改善肠道菌群结构、增强免疫功能、降低血清胆固醇、改善肥胖、延缓衰老和抗肿瘤等方式对人体健康发挥积极作用[1]。近年来，随着检测技术的不断更新，益生菌与人体健康的关系及其作用机制得到了深入研究。例如，“肠-脑轴”和“肠-肝轴”等作用机制[2]的研究表明，由肠道细菌产生的小分子代谢物进入大脑后，能改变脑细胞功能，从而影响人的情绪和认知。因此，新技术的发展为益生菌和宿主的关系及相互影响机制的研究提供了新的可能。目前，益生菌类产品多以复合益生菌及益生菌+益生元等形式出现[3-5]，菌种多样性和基质复杂性成为益生菌检测和鉴定面临的新挑战。

2 益生菌鉴定技术

细菌鉴定技术可用于食品中菌种的定性和溯源，对食品中益生菌质量控制和监管起重要作用。益生菌鉴定分为表型微生物鉴定方法和以基因组序列为基础的基因型微生物鉴定法[6]。

2.1 表型微生物鉴定方法

传统鉴定方法培养周期长，要用到很多生化试剂，且过程烦琐，难以满足快速检测的需要。对于复合菌株而言，传统鉴定方法难以鉴定相似种及亚种的菌株。传统鉴定方法的优点是成本低，仅需要简单的显微镜等基本设备即可完成检测和鉴定，因此大多数鉴定方法都要基于平板培养的方法对菌株进行初步分离、培养和收集[7-9]。

从手工操作的生化鉴定系统（如梅里埃的API微生物鉴定系统），到各种自动化生物鉴定设备的出现（如Biolog公司设计的Biolog微生物鉴定系统），再到与质谱技术结合的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技术的应用，检测速度和效率较人工鉴定方法获得了大幅度提升。例如，许再元[7]用生化鉴定系统鉴定双歧杆菌发现，API鉴定系统只能在属的水平上进行鉴定，在种水平上的鉴定则存在一定的局限，推测可能与双歧杆菌生化反应的多变性有关。Biolog微生物鉴定系统6.01版的厌氧数据库已收录双歧杆菌属的29个标准菌种，占该属总数的91%[10]，但对于相似菌株的鉴定还有待提升。

MALDI-TOF MS通过检测微生物中能稳定表达的蛋白（如核糖体中的蛋白）来绘制特征指纹图谱，将绘制出的特征指纹图谱与数据库中已知指纹图谱进行比对，从而实现快速鉴定。范铁男等[11]研究发现，对单一菌株进行MALDI-TOF MS鉴定仅需不到15 min，对实验中的79株菌株进行鉴定则仅需约5 h，说明该技术适用于益生菌的高通量鉴定及筛选。

组成生物体的各种分子基团因其化学结构的不同，分子振动频率也有所差异，从而导致吸收光谱和折射率谱不同。红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectrometer，FT-IR）技术和太赫兹时域光谱技术（Terahertz Time-Domain Spectroscopy，THz-TDS）[12]能够在不损伤微生物的情况下，反映菌种DNA、RNA、多糖蛋白等分子的结构差异。这些技术可作为菌种鉴定的辅助方法，但目前在益生菌菌种鉴定中的应用较为少见。

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是一种免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术。该技术基于抗原-抗体相互作用的原理，通过酶标记抗原并产生显色反应，从而实现目标分子的定量检测，主要用于检测生物样品中的特定蛋白质、肽、抗体或抗原。目前，该方法多用在临床检测[13-14]，在益生菌检测方面的应用较少[15]。

2.2 基因型微生物鉴定法

2.2.1 聚合酶链式反应鉴定方法

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在DNA聚合酶和引物的参与下，根据碱基互补配对原则进行DNA扩增的技术。对DNA进行扩增可得到高浓度的DNA分子，结合凝胶电泳和荧光信号等技术，如PCR-脉冲场凝胶电泳（PCR Pulsed Field Gel Electrophoresis，PCR-PFGE）、PCR-变形梯度凝胶电泳（PCR Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）、荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）等，可对扩增的基因进行分离、鉴定和定量分析。

DNA的磷酸基团长度与电荷数相关，PCR-PFGE技术正是利用这一原理，将PCR扩增后的DNA分子置于电场加持下的无活性介质凝胶中，使含有不同电荷数的DNA分子因移动速度的不同而得到分离。对于10 kb以上的大分子DNA片段，PCR-PFGE技术也能进行有效分离。例如，在双歧杆菌的鉴定中，DURANTI等[16]结合多种方法和PCR-PFGE技术，成功地区分了各个种属的双歧杆菌；ŠRŮTKOVÁ等[17]研究发现，利用PFGE方法可以提高菌种的鉴定正确率。

PCR-DGGE技术是在PCR-PFGE技术的基础上，在电泳过程中梯度增加DNA解链变性剂，使DNA分子上不同位点的碱基对逐渐解链，变成长短不等的DNA分子，进而因携带电荷数不同在凝胶板上进一步分离。因此，PCR-DGGE可以把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。REQUENA等[18]对16S rDNA序列的保守区域进行了PCR扩增，并结合PCR-DGGE技术对粪便样品中的双歧杆菌进行了分离鉴定。

2.2.2 基因测序技术鉴定方法

基因测序技术以分子杂交技术为基础，根据测序的位点，可以分为16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA技术）、多位点序列分析（Multilocus Sequence Analysis，MLSA）、全基因组测序等。根据测序效率，基因测序技术可分为第一代的Sanger测序技术和下一代的高通量测序技术。

16S rRNA是一种细菌和古菌中都具有的核糖体RNA片段，因此常用于细菌系统发育树研究和分类鉴定[19]。16S rRNA基因不仅包含了菌种间基因表达相同的保守区，也包含了菌种间基因表达特异的高变区。16S rRNA的保守区可用于设计通用型引物；高变区常用于高通量测序以设计特异性扩增引物，通过与数据库中已知序列进行比对，可将双歧杆菌准确鉴定到种的水平，菌种的鉴定匹配率为99%～100%。段文锋等[9]从市场中常见的19例益生菌乳粉中分离得到28株双歧杆菌，利用16S rRNA技术对28株双歧杆菌进行了菌株鉴定，建立了基于双歧杆菌基因组序列的分子鉴定方法。然而，16S rRNA技术对于亲缘关系比较近的菌种分辨率不高[20]。

MLSA是将基因序列进行串联，增加有效信息位点数量，对难以区分的相似菌群进行鉴定的技术[21-22]。该技术常被用来研究物种间的遗传和变异关系。江建平等[23]挑选12株可用于食品的双歧杆菌，对7种管家基因的序列进行系统发育树分析，结果显示，采用MLSA技术得到的串联系统发育树与16S rDNA系统发育树结果一致，由于部分管家基因相比保守的16s rRNA有更高的分化程度，MLSA具有更高的分辨率。

高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是在Sanger测序技术[24]基础上发展起来的新一代基因测序技术，能同时测定大量核酸分子的序列，弥补了Sanger测序技术在检测效率方面的不足[25]。例如，多位点序列分型技术（Multilocus Sequence Typing，MLST）依赖于物种全基因组序列数据库和多位点序列分型数据库的丰富物种信息[26]，而NGS可快速丰富相关基因数据库的信息。再如，在益生菌鉴定中，NGS技术通过DNA提取、片段化、扩增等操作实现全基因组测序，提高了物种特异性引物的设计效率[27-28]。因此，NGS可广泛应用于生物种群的分类研究[28-29]、特异性引物的制备及益生菌产品的合规性判断[30]。陈卫等[31]提出了一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法，该方法以groEL基因为筛选标记，采用NGS技术1 d内可快速批量处理菌株信息，无须用传统的生化分析法即可在亚种水平上对复杂样品中的双歧杆菌进行全面鉴定，分辨率高于16S rRNA技术，对菌种和亚种的鉴定准确率达100%。

3 益生菌的定量检测方法

益生菌的传统定量检测方法有平板计数法和流式细胞计数法，目前新型的检测方法多为基因层面的分子生物学检测方法，如PCR方法及其衍生出的相关方法。

3.1 平板计数法

在采用平板计数法定量检测乳酸菌和双歧杆菌时，培养基的选择是影响菌种鉴定及准确定量的重要因素。《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35—2023）中提到，乳酸菌主要为乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌。对于嗜热链球菌的计数，国际标准和相关文献多推荐采用M17培养基来代替国家标准中的MC培养基[32-33]。ISO 7889：2003[34]中规定，用酸化MRS培养基对德氏乳杆菌保加利亚亚种进行分离计数，但该方法仅适用于发酵乳中只含有嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的样本，不具有普遍性。平板计数法只能在属的层面进行计数，对于复合益生菌的分别计数具有局限性。