高效液相法测定酱油中色氨酸含量

摘 要：本文用二极管阵列检测器（Photo-Diode Array，PDA）检测，外标法定量，考察水解条件、柱温、流动相pH值等参数对酱油中色氨酸含量检测结果的影响。结果表明，采用0.10 mol·L-1氢氧化钠溶液水解，反相C18柱分离，柱箱温度35 ℃，流动相水相pH=4.5时条件最优，样品中色氨酸能完全分离，10～100 μg·mL-1线性关系良好，相关系数均大于0.999，加标回收率92.0%～95.0%，相对标准偏差（n=6）均低于10%。方法简单、快速、准确，可满足酱油中色氨酸的检测要求。

关键词：高效液相色谱；酱油；色氨酸；含量

Determination of Tryptophan Content in Soy Sauce by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Xuexue1， XIE Chunjiang1， ZHANG Hui1， HUANG Peng2， Cirenlama2， Gesangyangzong2

（1.Hefei Institute of Metrology and Testing， Hefei 230088， China; 2.Shannan Market Supervision and Administration， Shannan 856000， China）

Abstract： This article uses photo-diode array （PDA） detection and external standard method quantification to investigate the effects of hydrolysis conditions， column temperature， mobile phase pH value and other parameters on the detection results. The results showed that the optimal reaction conditions were 0.10 mol·L-1 sodium hydroxide solution hydrolysis， reversed phase C18 column separation， column temperature 35 ℃， mobile phase pH value is 4.5， and tryptophan in the sample can be completely separated. The linear relationship between 10 μg·mL-1 and 100 μg·mL-1 was good， and the correlation coefficients were all greater than 0.999. The recoveries were 92.0% to 95.0%， and the relative standard deviations （n=6） were all lower than 10%. The method is simple， rapid and accurate， and can meet the requirements of tryptophan detection in soy sauce.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; tryptophan; content

酱油，俗称豉油，一般由大豆、小麦、食盐等原料经制油、发酵等工序制作而成。酱油中成分较多，包括食用盐、氨基酸、糖类、有机酸类和各种色素等，以咸味为主，伴有鲜、香等味道，为常见的调味品，能提升菜肴味道，改变菜肴色泽[1-5]。

色氨酸为人体必需氨基酸，为酱油产品质量标准的一个重要指标。色氨酸通过螯合反应与食品中微量金属离子有机结合，得到具有理化性质稳定、生物活性较高的有机螯合物[6]。

目前，文献报道的关于色氨酸含量的测定方法主要有氨基酸分析仪法、衍生色谱法、凯氏定氮法等[7-14]。氨基酸自动分析仪存在价格较贵、分析时间过长等不足，且单一波长扫描，定性的准确性存在问题；衍生色谱法需合适的衍生剂与样品反应，分析效率较低，且衍生剂一般价格较高。凯氏定氮法则是通过间接测定氨基酸中氮含量来折算氨基酸含量，分析过程较复杂，分析结果准确性不高。在检测色氨酸含量时，为提高分析检测灵敏度，现有的高效液相色谱法通常将色氨酸衍生后进行色谱分析，色氨酸的衍生步骤复杂，衍生试剂昂贵。因此，本研究开发出一种操作简便、经济、灵敏度高和结果可靠的检测方法，可用于酱油中色氨酸含量的测定，为保障市场酱油品质提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-色氨酸标准品（美国Sigma公司）；氢氧化钠（分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（二极管阵列检测器Photo-Diode Array，PDA），日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液、试剂的配制

①1 000 μg·mL-1 L-色氨酸标准储备溶液。准确称取L-色氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解，定容，摇匀，4 ℃下避光保存。②L-色氨酸标准工作液。分别准确移取L-色氨酸标准储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL和1.0 mL到10 mL容量瓶中，纯水溶解，定容，得到系列标准工作液的浓度分别为10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1，4 ℃保存。③0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液。称取0.4 g氢氧化钠，溶解于100 mL水中。④Na+浓度0.01 mol·L-1，pH=4.5的乙酸钠缓冲溶液。称取0.82 g无水乙酸钠，溶解于1 000 mL水中，冰醋酸调节pH值至4.5。流动相为乙酸钠缓冲溶液∶甲醇=90∶10（V∶V）。

1.3.2 样品前处理

称取0.2 g酱油样品于蛋白质水解管中，加1.0 mL氢氧化钠溶液，振摇混匀，充氮气1 min，密封，放入（110±2）℃的烘箱水解22 h，取出水解管，冷却至室温，用乙酸钠缓冲溶液将水解液定量转移至50 mL容量瓶中，用乙酸钠缓冲溶液定容，过膜，上机分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；最大吸收波长：278 nm；流动相：乙酸钠缓冲溶液（pH=4.5），甲醇；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：35 ℃。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

流动相为乙酸钠缓冲液-甲醇，比较甲醇比例为5%、8%、10%、15%和20%（V/V）的5种流动相，发现甲醇比例超过10%会出现盐析现象，且色氨酸出峰处干扰较大，流动相中甲醇含量偏低则会导致分析时间过长。综合考虑，选择甲醇比例为10%（V/V）的流动相。

比较不同浓度（0 mol·L-1、0.001 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1和0.020 mol·L-1）的乙酸钠缓冲液（pH=4.5）对色氨酸出峰效果的影响，结果显示，当乙酸钠浓度达到0.01 mol·L-1时，色氨酸的分离效果佳，峰形较好。随着乙酸钠浓度的降低，色氨酸出峰处有杂质峰干扰，峰形较差，最终采用0.01 mol·L-1的乙酸钠缓冲盐体系作为流动相中的水相。

2.2 流动相pH值的选择

pH值对出峰状况及灵敏度存在一定影响，实验比较了不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5）的乙酸钠-乙酸缓冲体系对色氨酸色谱峰分离效果的影响。结果表明，随着流动相pH值的降低，色氨酸出峰时间后移，导致分析时间过长。当pH值为4.5时，色氨酸达到分离要求，峰形相对较好。随着pH值的降低，分离效果更好，但加入流动相中的乙酸含量大幅增加，长期使用会大大缩短色谱柱的使用寿命。当pH值降至4.5以下时，样品中杂峰对色氨酸的检测产生一定干扰。因此，将乙酸钠-乙酸缓冲体系的pH值定为4.5。

2.3 柱温对色谱分离的影响

随着色谱柱柱温的升高，出峰时间将会缩短，30～40 ℃考察柱温对色谱分离的影响。当柱温低于35 ℃时，对色氨酸的检测有干扰；柱温高于35 ℃时，出峰越来越快，分离效果逐渐下降，容易被杂质峰干扰。综合考虑，最终设定35 ℃作为该实验柱温。

2.4 水解条件的选择

色氨酸在酸水解条件下结构容易被破坏，一般选择碱水解方式。以空白样品为基质，添加相同质量的大豆蛋白质，1.0 mL（0.01 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1和0.50 mol·L-1）的氢氧化钠溶液110 ℃水解22 h，比较目标物的峰面积。图1表明，色氨酸的峰面积随水解浓度的增加而增大，氢氧化钠溶液浓度为0.10 mol·L-1时，色氨酸的峰面积趋于平稳，表明大豆蛋白质中酰胺键完全断裂，完全水解。因此，本实验选用0.10 mol·L-1氢氧化钠溶液水解蛋白质。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准谱图和曲线线性关系

在设定色谱条件下，采用HPLC-PAD分析，色氨酸峰形良好，如图2。选择280 nm为色氨酸的最大吸收峰，该波长下灵敏度高，干扰小。在色氨酸浓度为10～100 μg·mL-1下，以峰面积为Y轴，色氨酸浓度为X轴做标准曲线，线性方程为Y=35 182.4X，具有良好线性关系，相关系数大于0.999。

选取合适浓度的L-色氨酸标准溶液进样分析，观察噪音强度，计算出3倍信噪比（S/N），将其作为检出限，稀释L-色氨酸标准溶液，使其在仪器上响应强度为3倍噪音值，得到L-色氨酸检出限为0.003 g·kg-1。稀释L-色氨酸标准溶液，使其响应强度为10倍噪音值，将10倍信噪比（S/N）作为定量限，得到L-色氨酸的定量限为0.01 g·kg-1，试验结果表明所建方法灵敏度较高。

2.5.2 加标回收率及精密度

称取18份空白酱油样品，分别加入低、中、高（定量限、2倍定量限、10倍定量限）浓度的L-色氨酸标准溶液，依据1.3.2处理，外标法定量并计算加标回收率、相对标准偏差，结果见表1。结果表明，该方法重现性好，回收率较高，适用于酱油中色氨酸的测定。色氨酸精密度小于10%，可以满足检测要求。

2.5.3 样品检测

随机网购10份酱油，按照本实验方法检测，结果显示8份酱油中检出色氨酸，检出率80%，但含量存在一定差别。在酱油生产过程中，色氨酸结构可能遭到了破坏，故有产品未检出色氨酸。

3 结论

本研究优化了碱水解条件，选用乙酸钠-乙酸缓冲体系作为水相流动相，甲醇作为有机相流动相，提高了检测效率，增强了色氨酸的检测灵敏度。通过优化水相流动相的pH值以及柱温，改善了色氨酸的分离效果。本研究建立的方法具有灵敏度高、重现性好等优点，适用于酱油中色氨酸的检测。

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