腹泻病例中5种致泻性大肠埃希菌的分子分型研究

摘 要：目的：对腹泻病例中致泻性大肠埃希菌（DEC）进行PCR毒力基因检测，了解其流行特征，通过脉冲场凝胶电泳确定菌株之间的相关性，为预防疾病提供技术支持。方法：采集腹泻患者粪便，利用毛细管电泳仪对可疑DEC进行确认，收集患者信息，采用PFGE技术进行分子分型，用BioNumerics 软件进行聚类分析。结果：检出的92例DEC阳性病例中，0～12岁患者15例；13～44岁患者60例；45～59岁患者9例；≥60岁患者8例。92株DEC中共有89种带型，DNA条带相似度为9.36%～100.00%。结论：不同年龄人群检出率有所差异，年龄在13～44岁检出率最高。DEC菌株分子分型带型分散，呈现高度多态性。

关键词：致泻性大肠埃希菌；流行特征；脉冲场凝胶电泳

Molecular Typing of Five Diarrheagenic Escherichia coli

in Diarrhea Cases

WANG Xuemei， ZHANG Miao

（Zibo Center for Disease Control and Prevention， Zibo 255206， China）

Abstract： Objective： PCR virulence gene detection of diarrheagenic Escherichia coli （DEC） in diarrhea cases was carried out to understand its epidemic characteristics. The correlation between strains was determined by pulsed field gel electrophoresis， provide technical support for disease prevention. Method： Collect feces from diarrhea patients， confirm suspicious DEC using capillary electrophoresis， collect patient information， use PFGE technology for molecular typing， and use BioNumerics software for cluster analysis. Result： Among the 92 DEC positive cases detected， there were 15 cases aged 0～12 years old; 60 patients aged 13～44; 9 cases detected between 45 and 59 years old;  8 patients ≥60 years old. 92 strains of DEC have a total of 89 band types， with a DNA band similarity of 9.36%～100.0%. Conclusion： The detection rate varies among different age groups， with the highest detection rate occurring between the ages of 13 and 44. The molecular typing bands of DEC strains are scattered and exhibit high polymorphism.

Keywords： diarrheagenic Escherichia coli; popular characteristics; pulsed field gel electrophoresis

大肠埃希氏菌是人体的正常菌群，后来人们发现某些大肠埃希菌可引起腹泻并在人群中流行，称为致泻大肠埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）。20世纪90年代，DEC被列为食品中致病菌之首[1]。根据携带毒力基因的不同，分为肠集聚黏附性大肠埃希菌（Enteroadherent Escherichia coli，EAEC）、肠道致病性大肠埃希菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、肠道侵袭性大肠埃希菌（Enterinvasive Escherichia coli，EIEC）和肠出血性大肠埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）[2]。脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型主要用于病原体的溯源研究，其原理是用琼脂块将细菌包埋，选取适合的内切酶进行酶切，使酶切片段在电泳中通过变换电场方向而得到良好的分离。本研究通过对腹泻人群分离的DEC进行PFGE分子分型，旨在了解腹泻患者DEC感染的菌株间基因型联系和差异，为DEC的防控及分子分型的数据库提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株为腹泻病例粪便中分离的DEC 92株。PCR、PFGE分别以5种致泻大肠标准菌株和布伦登卢普沙门菌H9812作为质控菌株。

麦康凯平板（北京路桥）；营养琼脂（北京路桥）；血琼脂平板（北京路桥）；核酸提取试剂盒（苏州天隆）；致泻性大肠埃希菌多重PCR检测试剂盒（卓诚惠生）；全自动毛细管电泳试剂盒（卓诚惠生）；XbaI（TaKaRa生物公司）。

1.2 仪器与设备

核酸提取仪（NP968，苏州天隆）；PCR仪（Mastercycler gradient，eppendorf公司）；多重食源性致病菌核酸检测系统（PathoMPSTM，凯杰公司）；恒温振荡水浴摇床（DSHZ-300A，太仓市实验设备厂）；脉冲场电泳仪（CHEF Mapper XA，Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（Gel Doc XR+，Bio-Rad公司）。

1.3 实验方法

（1）将可疑DEC划线麦康凯平板进行分离培养，挑取可疑菌落，划线营养琼脂后进行PCR毒力基因检测，根据所携带的毒力基因进行型别鉴定。

（2）将菌落划线血琼脂平板，37 ℃培养14～18 h。

将细菌均匀悬浮于配制好的CSB中制成4.0～4.5麦氏单位的菌悬液，加入20 mg·mL-1蛋白酶K后加1%琼脂糖，待其凝固制成小胶块，水浴摇床150 r·min-1左右温育2 h。用无菌超纯水洗2次，再用TE缓冲液洗涤4次。

（3）用内切酶XbaIⅠ对切成2 mm的小胶块进行酶切，酶切时间至少2 h。将酶切后的胶块置于梳子上，倒入1%琼脂糖，冷却后放入电泳仪电泳19 h。

（4）将电泳后的胶块取出用GelRed染液染色，纯水清洗后，凝胶成像仪获取图像，用 BioNumerics软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 患者发病年龄分布

0～12岁患者检出15例，占16.30%；13～44岁患者检出60例，占65.22%；45～59岁患者检出9例，占9.78%；≥60岁患者检出8例，占8.70%，见表1。

2.2 PFGE分子分型

对92株携带毒力基因的DEC进行PFGE分子分型，相似度最高为100%，最低的只有9.36%，主要结果见图1。

3 讨论

据WHO统计，全球每年约有20亿感染性腹泻患者。感染性腹泻已成为全球性重要公共卫生问题，仅在2000年腹泻引起的死亡报告数就达到210万例[3]。DEC是引起腹泻的主要病原菌之一，从腹泻患者中分离的比例呈上升趋势。有研究显示，DEC感染在细菌性感染腹泻中居首位[4]。

通过对DEC患者进行年龄段分析，结果表明，13～44岁患者DEC的检出率较高，可能与该年龄段外出就餐频繁，同时对食品卫生重视程度不高有关，因此在加强食品监管的同时也要做好食品卫生安全的健康教育。本文研究结果与相关文献中的结果基本相符[5]，与河南省5岁以下儿童为高发人群的结果不符[6]。

目前常用的分子分型技术主要有mPCR技术、重复序列PCR技术、PFGE技术。mPCR是在同一个反应体系中加入一对以上引物，分别扩增不同的模板，得到不同的目的片段[7]。重复序列PCR技术是一种细菌基因组指纹分析方法，是扩增细菌基因组中的短重复序列，主要通过比较电泳条带，分析基因组间的差异[8]。PFGE是PulseNet China重要的病原菌分型技术，可实现全球监测结果的比对[9]。PFGE是细菌分子分型技术的“金标准”，通过比较菌株之间PFGE图谱条带分析菌株间同源性和相关性[10]。TALON等[11]提出细菌条带相似度在85%以上为同源克隆菌株。运用PFGE技术对腹泻病例中检出的DEC菌株进行同源性分析，并对相关病例进行流行病学调查，判断是否发生流行，可提高疾病预警能力[12]。

本研究选取腹泻病人粪便中分离的大肠埃希氏菌，通过毛细管电泳仪检测其毒力基因，共检出DEC 92株，其中EAEC 60株、ETEC 20株、EPEC 10株，EHEC、EIEC各1株。此次检测发现，4株ETEC细菌条带的相似度为100%。其中3株来自2017年在同一医院就诊的3名病例，1株来自2016年在此医院就诊的病例。在不同时间不同患者中检出同一带型的ETEC，有报道称可能会存在部分菌株因其遗传特性比较稳定，在环境中长期存在[13]。另外，2株来自同一病例携带不同毒力基因组合的EAEC，DNA条带相似度为100%。检测的大多数菌株的条带相似度低于85%，说明由DEC引起患者腹泻的菌株，其基因型存在多态性，以散发病例为主。

综上所述，通过对腹泻病例中分离的DEC进行PFGE分子分型，为DEC病例的监测和控制提供参考数据，为深入研究DEC分子多样性提供基础，为DEC导致腹泻的分子流行病学研究提供依据，对暴发预警及溯源调查具有重要意义。

参考文献

[1]严纪文，朱海明，宋曼丹，等.广州市市售食品中致泻性大肠埃希氏菌污染状况调查分析[J].华南预防医学，2002，28（4）：37-39.

[2]赵红庆，范锡铜，王玉飞，等.多重PCR检测致腹泻大肠埃希氏菌方法的建立[J].中国卫生检验杂志，2009，19（10）：2223-2226.

[3]WHO N D.Food safety and foodborne illness[J].Biochimica Clinica，2002，26（4）：39.

[4]时全，黄新明，李朝阳，等.致泻大肠埃希菌感染在腹泻病中地位的研究[J].中国卫生检验杂志，2005，15（1）：5-8.

[5]CHA S B，YOO A N，LEE W J，et al.Effect of bacteriophage in enterotoxigenic Escherichia coli （ETEC） infected pigs[J].Journal of Veterinary Medical Science，2012，74（8）：1037-1039.

[6]韩秀兰，柳连顺，杜敏，等.致泻性大肠埃希菌病原学分布研究[J].中国医学检验杂志，2001，2（4）：258-261.