微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度评定

摘 要：目的：评估微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的测量不确定度。方法：依据《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》（RB/T 151—2016）及《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》

（GB 5009.211—2022）评估测试过程中各主要因素引入的相对标准不确定度分量，进而对其进行合成与扩展。结果：当试样叶酸含量为66.1 μg/100 g时，其扩展不确定度为5.2 μg/100 g，包含因子k=2，置信概率95%。结论：重复性测量、标准物质称量、标准溶液配制及系列管制备、标准曲线拟合等测量不确定度分量对检测结果的影响较大。

关键词：微生物法；婴幼儿配方乳粉；叶酸；测量不确定度

Uncertainty Evaluation for the Determination of Folic Acid in Infant Formula Milk Powder by Microbiological Method

Gao Lihai， Chen Qiuming， Zhong Yanhua

（Jingyihetai Quality Testing Co.， Ltd.， Guangzhou 510700， China）

Abstract： Objective： To establish an uncertainty evaluation method for the determination of folic acid in infant formula milk powder by microbiological method. Method： According to RB/T 151—2016 and GB 5009.211—2022， the components of measurement uncertainty generated in the process of determining folic acid content in infant formula milk powder by microbiological method were analyzed， and the combined standard uncertainty and expanded uncertainty of measurement results were calculated. Result： When the folic acid content of the sample was 66.1 μg/100 g， with an expanded uncertainty was 5.2 μg/100 g， with a coverage factor of k=2 and a confidence probability of 95%. Conclusion： The uncertainty components such as repeatability measurement， standard substance weighing， standard solution preparation and serial tube preparation， and standard curve fitting have a great impact on the test results.

Keywords： microbiological method; infant formula milk powder; folic acid; uncertainty evaluation

叶酸是一种水溶性维生素，又名蝶酰谷氨酸，在自然界主要以蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合成母体化合物而存在[1]。叶酸在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，缺少时会造成红细胞中血红蛋白减少、细胞发育停滞，出现巨幼红细胞性贫血疾病[2]。

目前，用来检测食品中叶酸含量的常用方法有仪器法（如高效液相色谱法）、试剂盒法（酶联免疫吸附法）和微生物法等[3-5]。其中，微生物法是国内外普遍采用的检测方法，也是我国食品安全国家标准推荐检测方法，但微生物生长影响因素较多，检测方法操作烦琐，容易造成结果偏差。因此，为提高试验检测结果的准确性与可靠性，本文依据RB/T 151—2016及GB 5009.211—2022等标准评估了微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度分量，进而对其进行合成与扩展，用来表征叶酸真值含量范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

叶酸质控样品来源于中国检科院；叶酸标准品（CAS：59-30-3，纯度99.7%）来源于安谱；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）ATCC 7469来源于美国典型菌株保藏中心。菌株储备用琼脂（220104）、乳酸杆菌肉汤（211118）、叶酸测定培养基（220418）来源于陆桥。

1.2 仪器与设备

CPA225D电子天平（精度0.1 mg）、QUINTIX513-1CN电子天平（精度0.01 mg）来源于赛多利斯；GNP-9270恒温培养箱来源于精宏；Cary60紫外可见分光光度计来源于安捷伦。

1.3 方法

按《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》（GB 5009.211—2022）规定的方法检测婴幼儿配方乳粉中叶酸含量。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量来源

根据《测量不确定度的要求》（CNAS-CL01-G003：2021）、《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》（RB/T 151—2016）等文件评定不确定度，确定影响检测结果的主要因素包含重复性测量、标准品称量、标准溶液配制及系列管制备、试样称量、试样溶液配制及系列管制备、仪器偏差及标准曲线拟合等几个方面。

2.2 各影响因素的相对标准不确定度评定

2.2.1 重复性测量

按照国标方法对婴幼儿配方乳粉中叶酸含量进行6次平行测定，重复性测量产生的标准不确定度属于A类不确定度。重复性测定结果见表1。

根据贝塞尔公式计算标准差为

同一个样品重复进行2次测定，结果取平均值，计算标准不确定度为

2.2.2 标准品称量

2.2.3 标准溶液配制

根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）、《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允许误差，结合使用次数与器具容量，计算各器具的相对标准不确定度（假设矩形分布，包含因子为），结果见表2，则标准溶液配制的相对标准不确定度为

2.2.4 标准系列管制备

合成上述2.2.2、2.2.3、2.2.4各因素引入的相对标准不确定度为

2.2.5 试样称量

根据使用的电子天平（精度为0.001 mg）的检定证书可知，当0.02 g≤m≤50 g时，允差为±0.5 mg，

2.2.6 试样溶液配制

2.2.7 试样系列管制备

合成上述2.2.5、2.2.6、2.2.7各因素引入的相对标准不确定度为

2.2.8 标准曲线拟合

标准曲线线性回归方程y=0.679 8x+0.255 9，截距a=0.255 9，斜率b=0.679 8。测定次数为27，测试点数据见表6，则残差的标准差为

按照GB 5009.211—2022，试样系列管中分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL试样稀释液，每个梯度做3个平行，即测定9次，测得吸光值，叶酸含量见表7。

计算标准曲线拟合引入的标准不确定度为

2.2.9 紫外可见分光光度计

根据仪器校准证书可知，包含因子k=2，置信概率95%，扩展不确定度为0.2%，则计算其相对标准不确定度urel（S5）=0.002/2=0.001。

2.3 各影响因素的相对标准不确定度合成、扩展及表示

2.3.1 各影响因素的相对标准不确定度分量合成、扩展

各影响因素的相对标准不确定度如表8所示，则合成相对标准不确定度为

当包含因子k=2，置信概率95%，计算其相对扩展不确定度Urel=0.039×2=0.078 6。

2.3.2 测量不确定度表示

按照标准规定方法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量，均值为66.1 μg/100 g，扩展不确定度为U95=0.078 6×66.1 μg/100 g=5.2 μg/100 g，包含因子k=2，置信概率95%。

3 结论

通过分析和评估测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度分量可知，影响较大的因素是重复性测量、标准溶液配制、标准曲线拟合，其中标准溶液配制影响较大是标准品称量与标准系列管制备，相对标准不确定度分别为0.020 5和0.017 6，标准曲线拟合相对标准不确定度为0.023。因此试验过程中要严格按照标准规定，规范实验操作流程，加强人员培训，从而获得更好重复性，同时尽量使用高精密度电子天平称量标准品，购买正规厂家玻璃器皿，定期计量和维护，对检测仪器要定期校准，以确保检验结果的准确性。

参考文献

[1]GEISEL J.Folic acid and neural tube defects in pregnancy： a review[J].Journal of Perinatal & Neonatal Nursing，2003，17（4）：268-279.

[2]史方，唐慧骥，李传民，等.微生物法测定乳粉中叶酸的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2021，12（3）：968-974.

[3]李江，严家俊，綦艳，等.酶联免疫法快速检测奶粉中的叶酸[J].中国乳品工业，2017，45（10）：37-38.

[4]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中叶酸的测定：GB 5009.211—2022[S].北京：中国标准出版社，2022.

[5]刘娜，陈大舟，汤桦，等.婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定[J].分析测试学报，2008（4）：408-411.