基于FRET的荧光猝灭法在食品检测中的应用

摘 要：文章以生物质材料鸭蛋清为原料，通过微波法快速合成了具有长波长荧光发射的鸭蛋清金银纳米簇（Duck Egg White-AuAg Nanoclusters，DEW-AuAgNCs）。DEW-AuAgNCs可作为能量供体，结晶紫作为受体，建立了一种基于FRET的荧光猝灭法用于检测水产品中的结晶紫（Crystal Violet，CV）。该纳米簇在380 nm激发波长下，最大发射峰位于682 nm。研究发现，DEW-AuAgNCs的荧光光谱与CV的紫外可见吸收光谱有重叠，基于DEW-AuAgNCs和CV之间的荧光共振能量转移作用，DEW-AuAgNCs在682 nm处的荧光被CV选择性的猝灭。该方法具有选择性好、检出限低的优点，在水产品中CV的检测方面有一定的应用前景。

关键词：D-A型荧光探针；食品检测；结晶紫

Application of Fluorescence Quenching Method Based on FRET in Food Detection

XU Sifan

（Institute of Food Inspection and Testing， Jiangxi Provincial Inspection and Certification Institute， Nanchang 330052， China）

Abstract： In this paper， DEW-AuAgNCs of duck egg white with long wavelength fluorescence emission were synthesized by microwave method using biomass material as raw material. DEW-AuAgNCs can be used as energy donor and crystal violet as accepter. A FREt-based fluorescence quenching method was established for the detection of crystal violet （CV） in aquatic products. At the excitation wavelength of 380 nm， the maximum emission peak of the nanocluster is located at 682 nm. It was found that the fluorescence spectrum of DEW-AuAgNCs overlapped with the UV-vis absorption spectrum of CV. Based on the fluorescence resonance energy transfer between DEW-AuAgNCs and CV， the fluorescence of DEW-AuAgNCs at 682 nm was selectively quenched by CV. This method has the advantages of good selectivity and low detection limit， and has a certain application prospect in the detection of CV in aquatic products.

Keywords： D-A fluorescent probe; food testing; crystal violet

荧光法具有快速、操作简单和灵敏度高等优点，被广泛应用于结晶紫（Crystal Violet，CV）的检测。近年来，以金纳米簇为代表的纳米荧光材料获得越来越多的关注。金纳米簇的荧光性质与自身尺寸有关，当其粒径接近于电子的费米波长（0.5 nm）时，表现出类似分子的性质，如HOMO-LUMO跃迁和荧光特性等。随着金核数量的增加，荧光将会发生红移，这使金纳米簇具有可调节的荧光波长[1]。长波长发射的金纳米簇可以很好地降低生物自体的背景荧光干扰，为生物样品的实际检测提供了基础。此外，由于银原子拥有和金原子相似的尺寸和化学性质，故在金纳米簇合成过程中，银的加入使二者表现出协同效应，使双金属纳米簇表现出比单一金属纳米簇更大的尺寸以及更强的荧光和催化活性。因此，本文以生物质材料鸭蛋清为模板采用简单的微波法快速制备了具有长波长荧光发射的鸭蛋清金银纳米簇（Duck Egg White-AuAg Nanoclusters，DEW-AuAgNCs），并构建了一种基于FRET的检测水产品中残留CV的新方法，实现了CV的简单快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

结晶紫（2 mmol·L-1）：称取0.081 6 g CV粉末，用超纯水定容于100 mL容量瓶，再转移至棕色试剂瓶，4 ℃储存备用；六水合氯金酸（5 mmol·L-1）：称取HAuCl4·6H2O 0.205 6 g，用超纯水定容于100 mL容量瓶，再转移至棕色试剂瓶4 ℃储存备用；硝酸银（5 mmol·L-1）：称取0.042 4 g AgNO3，用超纯水定容于50 mL容量瓶，4 ℃储存于棕色试剂瓶。实验所用试剂全部为分析纯，实验用水为超纯水，电阻率≥18.25 MΩ·cm。

1.1.2 实验仪器

Luminous荧光分光光度计，美国赛默飞公司；UV2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电子显微镜，美国FEI公司；Escalab 250Xi X射线光电子能谱仪，美国赛默飞公司；IRTracer-100傅立叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；FLS980荧光光谱仪，英国爱丁堡公司；Nano ZS-90动态光散射纳米粒度分析仪，英国马尔文公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DEW-AuAgNCs的合成

以鸭蛋清、氯金酸和硝酸银为前体，采用一步微波法在1 min内快速合成DEW-AuAgNCs。取鸭蛋清置于锥形瓶中，磁力搅拌10 min，并超声20 min充分混匀。向锥形瓶中依次加入1.7 mL的鸭蛋清、2.4 mL的5 mmol·L-1 HAuCl4和185 µL的5 mmol·L-1 AgNO3溶液，磁力搅拌2 min后，逐滴加入800 µL的1 mol·L-1 NaOH溶液，搅拌2 min，放入微波炉中，225 W反应1 min，得到深黄色液体。为去除未反应完的鸭蛋清、HAuCl4和AgNO3，采用50 KD截留量的超滤管4 000 r·min-1离心20 min对DEW-AuAgNCs纯化处理，弃去滤出液，将浓缩液置于4 ℃避光储存。同时分别在不添加AgNO3和HAuCl4的条件下采用相同的方法合成DEW-AuNCs和DEW-AgNCs。

1.2.2 TEM表征

分别吸取适量的DEW-AuAgNCs溶液，滴加到铜网上，待完全干燥后，采用透射电镜观察DEW-AuAgNCs的形貌、分布及粒径大小。

1.2.3 XPS表征

将载玻片裁成1 cm×1 cm大小的正方形，王水浸泡24 h后用大量超纯水清洗。将DEW-AuAgNCs滴加到载玻片上，放入真空干燥箱，待完全干燥后，采用X射线光电子能谱仪分析DEW-AuAgNCs的元素种类[2]。

1.2.4 红外表征

将鸭蛋清和DEW-AuAgNCs分别进行冷冻干燥处理，得到固体粉末，压片后上机扫描红外光谱。

1.2.5 结晶紫检测体系的建立

依次向pH值为5的NH4Ac-HAc缓冲液中加入50 µL DEW-AuAgNCs和50 µL不同浓度的CV标准溶液，放入恒温混匀仪中30 ℃反应5 min，上机扫描其荧光光谱。在380 nm激发波长下，记录682 nm处的荧光强度，并计算荧光猝灭效率（F0-F）/F0（F0和F分别为加入CV前后的荧光强度值）。以（F0-F）/F0为纵坐标，CV的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 实际样品的检测

于当地市场购买新鲜鲫鱼和草鱼，分别取适量鱼肉利用组织研磨仪粉碎后，准确称取5 g，加入13 mL乙腈并超声30 min，离心取上清液。向沉淀中再加入12 mL乙腈，再次超声30 min，离心取上清液。合并两次提取液，放入真空干燥箱挥干乙腈，再加入25 mL超纯水后检测其中的CV含量，并进行加标回收实验。

2 结果与分析

2.1 DEW-AuAgNCs的形成

以鸭蛋清为保护剂和还原剂，采用一步微波法合成了DEW-AuAgNCs。DEW-AuAgNCs的形成过程可分为3步。①在碱性条件下，HAuCl4和AgNO3可被蛋白质中具有还原性的成分（酪氨酸和半胱氨酸残基）还原为零价的金和银。由于AuCl4-的还原电势低于Ag+，故金的还原速度比银相对要快，因此被还原的Au原子先沉积形成金核[3]。②Ag+在先形成的金核表面形成金属键，同时金核催化了银核的沉积。③金核和银核共沉积从而形成合金核，并在蛋白质模板内部进一步聚集，形成了具有强荧光发射的金银纳米簇。

2.2 DEW-AuAgNCs的表征

采用透射电子显微镜观察了DEW-AuAgNCs的大小和形态。由图1（a）可以看出DEW-AuAgNCs在水溶液中分散均匀，形状为近球形，无核壳结构。图1（b）的粒径在1.0～2.6 nm，平均尺寸约为1.83 nm。图1（a）的内插图为DEW-AuAgNCs在高分辨率透射电镜下的晶格结构图，通过Digital Micrograph软件分析得DEW-AuAgNCs的晶格间距约0.19 nm。

利用傅里叶变换红外（Fourier Transform Infrared，FT-IR）研究了DEW-AuAgNCs的化学结构和形成机理。图2是鸭蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR图，鸭蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR光谱具有极为相似的吸收峰。3 298 cm-1处的吸收峰与O–H和N–H的伸缩振动有关，1 531 cm-1处归因于C-N的特征峰，1 649 cm-1处属于C=O的振动吸收峰，这证明了酰胺I带和酰胺II带的存在；在合成DEW-AuAgNCs前后，酰胺键的位置没有发生明显的变化，表明所合成的AuAgNCs被包裹在鸭蛋清中。合成DEW-AuAgNCs后3 298 cm-1、1 649 cm-1和1 531 cm-1位置的峰强度均变弱，且3 298 cm-1的峰变宽，这表明AuCl4-和Ag+与蛋白质之间发生了相互作用，改变了蛋白质二级结构。

2.3 DEW-AuAgNCs检测CV的原理

本文以廉价的生物质材料鸭蛋清为模板，采用微波法快速（1 min内）合成长波长发射的DEW-AuAgNCs。合成的DEW-AuAgNCs在380 nm激发波长下，在682 nm处有最大荧光发射[4]。基于DEW-AuAgNCs与CV之间的FRET，DEW-AuAgNCs的荧光被CV选择性地猝灭，据此本研究构建一种荧光猝灭法检测水产品中残留的CV，检测原理如图3所示。

2.4 荧光猝灭机制的分析

常见的荧光猝灭机制有光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer，PET）、静电相互作用、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和内滤效应（Inner Filter Effect，IFE）。为探索CV猝灭DEW-AuAgNCs荧光的机制，通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱、Zeta电位和荧光寿命等一系列表征来系统的验证。由图4（a）可以看出，在添加CV标准溶液后，DEW-AuAgNCs的紫外吸收峰位置没有明显改变，且未出现新的吸收峰，因此DEW-AuAgNCs和结晶紫反应后没有产生新的复合物排除PET。由图4（b）可以看出，DEW-AuAgNCs、CV、DEW-AuAgNCs+CV的Zeta电位分别为-18.43 eV、-6.29 eV和-21.5 eV，DEW-AuAgNCs和CV均带负电荷，故二者之间不会发生静电相互作用。通过扫描DEW-AuAgNCs的激发光谱、发射光谱和CV的紫外可见吸收光谱，由图4（c）发现，DEW-AuAgNCs的荧光发射光谱和CV的紫外可见吸收光谱有部分重叠，因此，二者之间可能发生了FRET或IFE。