芒果中农药残留胶体金免疫层析快速检测方法的建立与应用

作者: 韦盈 李川 符郁馥 林志藩 郭晓宇 康蕊

芒果中农药残留胶体金免疫层析快速检测方法的建立与应用0

摘 要:目的:建立一种简便、快速检测芒果中吡唑醚菌酯等农药残留的方法。方法:芒果中的农药经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制抗体和试纸条中检测线(T线)上的抗原结合,从而产生检测线颜色深浅的变化。通过比较检测线(T线)与控制线(C线)颜色变化,对样品中吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺进行定性判定。结果:该方法对吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺的检出限分别为0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1,相对准确度分别为96.7%、100.0%、100.0%,经评价满足灵敏度≥95%、特异性≥85%、假阴性率≤5%、假阳性率≤15%的要求,胶体金试纸条检测结果与参比方法检测结果符合率为100%。结论:该快速检测方法无需大型仪器,操作简单,成本低,适用于芒果中农药残留的快速筛查。

关键词:免疫层析法;芒果;农药残留;快速检测

Establishment and Application of Colloidal Gold Immunochromatography for Rapid Detection of Pesticide Residues in Mango

WEI Ying1,2, LI Chuan3, FU Yufu1,2, LIN Zhifan1,2, GUO Xiaoyu1,2, KANG Rui1,2*

(1.Hainan Institute for Food Control, Haikou 570314, China; 2.Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety for State Market Regulation, Haikou 570314, China; 3.School of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China)

Abstract: Objective: To establish a rapid detection method of pesticide residues, which can simply and quickly detect pesticide residues such as pyraclostrobin in mango. Method: The pesticides in mango were extracted and combined with the specific antibody labeled with colloidal gold, which inhibited the combination of the antibody and the antigen on the test line (T line) in the test strip, resulting in the color change of the test line. Through the comparison of the color depth between the detection line (T line) and the control line (C line), the qualitative determination of pyraclostrobin, imidacloprid and clothianidin in the sample was made. Result: The detection limits of the method for pyraclostrobin, imidacloprid and clothianidin were 0.05 mg·kg-1, 0.20 mg·kg-1 and 0.04 mg·kg-1 respectively, and the relative accuracy was 96.7%, 100.0% and 100.0% respectively. The evaluation met the requirements of sensitivity≥95%, specificity≥85%, false negative rate≤5% and false positive rate≤15%. The coincidence rate between the test results of colloidal gold test strip and the test results of reference method is 100%. Conclusion: This rapid detection method does not need large instruments, is simple to operate and low in cost, and is suitable for rapid screening of pesticide residues in mango.

Keywords: immunochromatography; mango; pesticide residue; rapid detection

芒果,系多年生热带、亚热带水果,是仅次于香蕉的世界第二大热带水果[1]。芒果果实含有丰富的糖、维生素、蛋白质、粗纤维和微量元素,其果肉细腻可口,营养物质丰富,深受人们喜爱[2]。我国芒果主要产区分布于海南、广西、云南、广东、四川、福建和台湾等省区[3-4]。目前芒果产业已经成为我国热带和亚热带地区支柱产业之一,在推进农业结构优化调整、农民增收、扩大出口和满足人们的生活需求等方面发挥着重要作用。

果蔬中农药残留超标是消费者最关注的食品安全问题。马晨等[5]对海南芒果中农药残留情况进行了分析,发现芒果中不合格率较高的农药残留分别是吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺,不合格率分别为21.91%、19.1%、2.81%。目前农药的检测方法主要是实验室仪器法,该方法不仅需要高精端仪器和专业人员,而且操作复杂,检测时间长,很难控制在销售期内完成检验,无法有效保证食品安全。因此,利用快速检测技术对市场上芒果进行农药残留检测很有必要。

农药残留常见的快速检测方法是酶抑制率法和拉曼光谱法。酶抑制率法主要用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药,由于酶易受色素、植物次生物质影响,其适用的种类有限,准确度也不够高[6]。拉曼光谱法因需要建立数据库,且选择的基底有限,不能被广泛应用。胶体金免疫层析技术是一种以胶体金作为示踪标志物,抗原抗体特异性竞争的新型检测技术。由于其具备快速、操作简单、成本低、无需贵重设备等优点,被广泛应用于各检测领域。随着各种农药抗体的成功制备,近几年该技术越来越多地被运用到农药残留检测中[7]。胶体金免疫层析技术与酶抑制率法相比,具有灵敏度高、抗干扰能力强等特点,可用于单一种类农药残留的检测分析。

吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉是芒果中风险较高的项目,目前没有同时检测这几种农药残留的快速检测方法,芒果基质的适用性也缺少相应研究。本研究旨在对胶体金免疫层析法同时检测芒果中吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺的快速检测技术开展应用研究,以期为芒果质量安全监管和生产者安全自检工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果来源于海南省海口市、东方市、昌江县果园、农贸市场和超市;吡唑醚菌酯残留检测试纸条、噻虫胺残留检测试纸条、吡虫啉残留检测试纸条和提取液,中检国研(北京)科技有限公司;柠檬酸钠二水合物、柠檬酸钠二钠盐倍半水合物、氯化钠和无水硫酸镁(分析纯),广州化学试剂厂;甲酸(色谱级),甲醇、乙腈(质谱级),默克公司;实验室用水由miili-Q A10超纯水机制备。

对照品:吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉、苯醚甲环唑、灭蝇胺、啶虫脒、丙溴磷、毒死蜱和克百威,纯度为99.5%,德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

TQ-S超高效液相-质谱串联仪,美国沃特世公司;XS205、XS204分析天平,美国梅特勒公司;Centrifuge 5804离心机,德国艾本德股份公司;MS3微量振荡器,德国IKA公司;10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液枪,德国BRAND公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

本方法采用胶体金免疫层析原理。样品中的吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉等农药经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制抗体和试纸条中检测线(T线)上抗原的结合,从而产生检测线颜色深浅的变化[8]。通过比较检测线(T线)与控制线(C线)颜色变化,对样品中吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉进行定性判定。

1.3.2 实验方法

取新鲜芒果擦去泥土,剪碎成小于1 cm见方的碎片。称取(2.00±0.05)g样品至15 mL离心管中,再加入5 mL提取液,盖上盖子,涡旋仪涡动或手动上下振荡1 min,静置2 min,得样品液。从原包装袋中取出试纸条。用一次性微型吸管吸取样品提取液,垂直缓慢滴加3滴(约100 μL)于加样孔(S孔)中。滴加后立即计时,10 min后,判定结果。

1.3.3 结果判定

本方法采用目测方式,通过比较检测线(T线)与控制线(C线)颜色,定性判定样品中是否含有待测物。如图1所示,T线与C线显色相同或T线显色深于C线,表示样品中未检出待测物或待测物浓度低于检测限,判为阴性(-);T线显色浅于C线,或者T线消失,表示样品中有待测物检出,判为阳性(+);C线不显色,表示试纸条已失效或前处理操作不正确,判为无效[8]。

1.3.4 评价方法

每个项目取芒果空白基质60份,设置空白样品、检出限1倍、检出限2倍3个浓度水平,每个浓度水平20例进行验证评价,对建立的快速检测方法进行灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率以及与参比方法一致性的分析,评价方法的灵敏度和准确度。

1.3.5 交叉反应实验

取芒果空白样品18份,分为3组,使用苯醚甲环唑、丙溴磷、灭蝇胺、毒死蜱、啶虫脒和克百威有证标准物质进行加标,使每组每个样品的干扰物浓度分别为5 mg·kg-1,吡唑醚菌酯残留检测试纸条、噻虫胺残留检测试纸条、吡虫啉残留检测试纸条各测试一组样品。

2 结果与分析

2.1 制样方式优化

取新鲜芒果分成2份,一份剪碎成小于1 cm见方的碎片,另一份用组织捣碎机匀浆,称取2 g样品进行实验。制样方式不同,胶体金卡呈现的显色效果不同。芒果被均质后样品内容物释放,对显色造成一定的干扰,不利于结果的判定,且试验过程中容易堵塞加样孔。故本研究采用剪碎成小于1 cm见方的碎片为制样方式。

2.2 提取时间优化

设置提取时间为1 min、2 min、5 min、10 min、30 min、60 min和120 min,称取2 g样品进行实验。结果表明,提取时间对阴性样品几乎无影响;对于阳性样品,提取时间为1 min、2 min、5 min、10 min和30 min时,目标物均可被很好地提取,30 min后随着提取时间增加,受环境影响目标物有所降解,阳性变弱。综合考虑样品提取时间以2~5 min为最佳,超过30 min未测定应重新取样进行处理。

2.3 免疫反应时间优化

设置免疫反应时间为1 min、2 min、5 min、8 min、10 min、15 min和30 min,称取2 g样品进行实验。免疫反应2 min时,样品可从样品孔沿NC膜(硝酸纤维素膜)层析至试纸条顶端,此时T线、C线初步显色,但显色不明显;2~5 min时,T线、C线继续增强,5 min时可以判读结果;5~8 min时,T线、C线显色继续增强,变化速度有所减慢;8~10 min时,T线、C线颜色不再增强。综合考虑,免疫反应时间以10 min为最佳。

2.4 检出限

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