食品中沙门氏菌缓冲蛋白胨水培养基的优化

作者: 王乐 陈佳 秦丽

食品中沙门氏菌缓冲蛋白胨水培养基的优化0

摘 要:目的:优化食品中沙门氏菌缓冲蛋白胨水培养基的配比,缩短检验周期,使食品安全预警时间点前移。方法:通过吸光度法和平板计数法同时测定不同优化条件下缓冲蛋白胨水培养基中沙门氏菌的生长曲线,对结果进行处理分析,确定最优方案,并采用实时荧光PCR法进行菌种验证。结果:吸光度法和平板计数法曲线变化基本一致,随着缓冲蛋白胨水培养基中酵母添加量的增加,沙门氏菌的调整期缩短,对数期斜率和稳定期数值呈增大的趋势。当改良缓冲蛋白胨水中酵母浸膏的添加量为9 g/L时,食品中沙门氏菌的前增菌时间缩短到8~10 h。通过实时荧光PCR法的验证,确定改良缓冲蛋白胨水培养基特异性良好。结论:根据实际情况选择缓冲蛋白胨水培养基中酵母的添加量,优化后的缓冲蛋白胨水培养基检测时间短、特异性强,可用于食品中沙门氏菌的快速检测,为商品化缓冲蛋白胨水培养基的生产提供参考依据。

关键词:食品;沙门氏菌;缓冲蛋白胨水培养基;优化

Optimization of Buffered Peptone Water Medium for Salmonella in Food

WANG Le1, CHEN Jia2, QIN Li3*

(1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center, Zhangjiakou 075000, China; 2.College of Chemical Technology, Shijiazhuang University, Shijiazhuang 050035, China; 3.Hebei Intellectual Property Protection Center, Shijiazhuang 050000, China)

Abstract: Objective: By optimizing the ratio of buffered peptone water medium for Salmonella in food, the detection period is shortened and the time point of food safety warning is moved forward. Method: The growth curve of Salmonella in buffered peptone water medium under different optimized conditions was determined by absorbance method and plate counting method simultaneously. The results were processed and analyzed to determine the optimal plan, and the real-time fluorescent PCR method was used to verify the strains. Result: The curve changes of absorbance method and plate counting method were basically the same. With the increase of yeast addition in buffered peptone water medium, the adjustment period of Salmonella was shortened, and the slope of logarithmic phase and the value of stable phase increased. When the addition amount of yeast extract in modified buffered peptone water was 9 g/L, the pre-enrichment time of Salmonella in food was shortened to 8~10 h. The specificity of the modified buffered peptone water medium was confirmed by real-time fluorescence PCR method. Conclusion: The amount of yeast added in the buffered peptone water medium should be selected according to the actual situation. The optimized buffered peptone water medium has a short detection time and strong specificity, and can be used for the rapid detection of Salmonella in food. This study can provide a reference for the production of commercial buffered peptone water medium.

Keywords: food; Salmonella; buffered peptone water medium; optimization

沙门氏菌(Salmonella)是一种最常见的、能引起人畜共患病的食源性致病菌,在人和动物体中有广泛的寄主[1]。我国由沙门氏菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位[2]。在消费者食用被沙门氏菌污染的食物后,会出现腹泻、肠胃炎、发热和败血症等一系列症状[3]。

近年来,随着生活水平的提高,人们对食品安全问题的重视日益增加。食品中富含各种营养物质,是食源性致病菌生长、繁殖的良好基质,而且食品在加工、包装、配送及储存等过程中也极易受到食源性致病菌污染[4]。因此,加强对食品中食源性致病菌的检测就显得十分重要。据世界卫生组织统计,沙门氏菌在食源性致病菌中排名第一,世界各国对于食品中沙门氏菌的检测要求都十分严格,沙门氏菌污染一直是食品行业检测的重要指标之一[5]。

目前,沙门氏菌的检测方法主要有传统培养方法、免疫学方法和PCR法[6-8]。随着科学技术的发展,多重PCR法、实时荧光PCR法、侧向流动检测法等一系列新方法也逐步开始应用于食品中沙门氏菌的检验[9-11]。但传统培养方法和现代检测技术都必须以目标菌的富集为前提,从而进行后续的检测[12]。前增菌过程可以实现目标菌的富集,是缩短增菌时间、降低背景干扰的有效手段[13]。沙门氏菌现行国家标准方法的前增菌是采用缓冲蛋白胨水培养基使样品中菌体恢复并大量增殖的过程,此步骤对后续检出率的影响至关重要,但其所需的检测时间较长[14]。因此,本研究以缓冲蛋白胨水培养基为基础,通过酵母添加量的优化,以期得到一种快速、特异性强的培养基,从而缩短前增菌时间,为我国食品安全的风险监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

实验所用的鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50976)购于中国医学细菌保藏管理中心。

1.2 试剂与仪器设备

酵母浸膏(Becton,Dickinson and Company);磷酸盐缓冲液、营养琼脂、缓冲蛋白胨水、平板计数琼脂(北京路桥技术股份有限公司);细菌基因组DNA提取试剂盒、2×PCR Master Mix(天根生化科技北京有限公司);引物及探针(生工生物工程上海股份有限公司)。

二级生物安全柜;多功能酶标仪(Synergy HTX);恒温培养箱(PHCbi);电子天平(ME4002E);Sigma 3K15冷冻离心机(德国Sigma公司);LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪(德国罗氏诊断有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌悬液的制备

把-80 ℃保存的鼠伤寒沙门氏菌CMCC50976加入到无菌磷酸盐缓冲液中,挑取菌悬液在营养琼脂平板上划线,36 ℃培养24 h,重复一次。挑取活化好的单菌落接种于磷酸盐缓冲液中,振荡均匀,将菌悬液的麦氏浊度控制在0.5~0.6。对上述菌悬液进行10倍梯度稀释,吸取100 µL菌悬液接种于平板计数琼脂上,36 ℃培养48 h后计数。菌悬液的浓度为7.7×106 CFU/mL。

1.3.2 酵母浸膏添加量的筛选

以缓冲蛋白胨水为基础,分别添加终浓度为

0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L的酵母浸膏,每瓶分装100 mL,高压灭菌。对添加不同浓度酵母浸膏(0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L)的改良缓冲蛋白胨水培养基接种1 mL 1.3.1中浓度为7.7×10-6 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌。空白培养基作为对照,与接种后的培养基同时放入36 ℃培养箱培养。

1.3.3 沙门氏菌OD550值的测定

沙门氏菌菌悬液培养2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后,分别用酶标仪测量550 nm波长下空白培养基和菌悬液的OD550值。以OD550值的大小衡量沙门氏菌生物量的多少,筛选出最佳酵母浸膏的添加量。

1.3.4 沙门氏菌平板计数法的验证

同时吸取1 mL菌悬液,10倍梯度稀释后接种在平板计数琼脂上,36 ℃培养48 h后计数。

1.3.5 实时荧光PCR法的特异性验证

采用试剂盒法对培养10 h后酵母浸膏浓度为9 g/L的改良缓冲蛋白胨水菌悬液进行DNA模板的提取,采用实时荧光PCR法验证其特异性。试验重复3次,设置阳性对照(沙门氏菌菌悬液基因组DNA),阴性对照(其他菌菌悬液基因组DNA)和空白对照(添加无菌水)。

实时荧光PCR法引物序列为P1:5'-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3';P2:5'AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3'。实时荧光PCR法探针序列为“FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMARA”。最终反应体系为2×PCR Master Mix 12.5 µL;上下游引物各0.5 µL;探针0.5 µL;DNA模板5 µL;双蒸水补足25 µL。反应程序为:预变性95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;65 ℃,30 s;40个循环。

2 结果与分析

2.1 生长曲线测定结果

由图1可知,沙门氏菌菌悬液OD550值随生长时间增加呈现上升的趋势,18 h后进入稳定期,培养24 h前没有出现衰亡期。添加酵母浸膏的改良缓冲蛋白胨水菌悬液,培养2 h后均结束调整期,进入对数增长期;缓冲蛋白胨水菌悬液,培养4 h后,才结束调整期,进入对数增长期。从整体趋势分析,改良缓冲蛋白胨水的增菌速度明显高于缓冲蛋白胨水,沙门氏菌在添加酵母浸膏的培养基中能够更快地恢复活性。随着缓冲蛋白胨水培养基中酵母添加量的增加,对数期斜率和稳定期数值基本呈增大的趋势。

2.2 平板计数测定的验证结果

由表1可知,不同酵母浸膏添加量的缓冲蛋白胨水菌悬液平板计数测定结果与OD550值的变化趋势基本相同,沙门氏菌的数量随时间增加呈现上升的趋势,与2.1中OD550值的变化趋势一致。

2.3 沙门氏菌第8 h和第18 h OD550值的比较

由图2可知,在第8 h,缓冲蛋白胨水菌悬液的OD550值最低,酵母浸膏添加量为3 g/L的改良缓冲蛋白胨水菌悬液的OD550值是其3倍。说明酵母浸膏的添加可以促进沙门氏菌的生长。随着缓冲蛋白胨水培养基中酵母浸膏添加量的增加,菌悬液的OD550值呈缓慢增长趋势,不同酵母浸膏添加量的改良缓冲蛋白胨水菌悬液的OD550值没有显著差异。在第18 h,缓冲蛋白胨水菌悬液的OD550值最低,随着缓冲蛋白胨水培养基中酵母浸膏添加量的增加,菌悬液的OD550值逐步增加,差异显著。酵母浸膏添加量为11 g/L的改良缓冲蛋白胨水菌悬液的OD550值达到0.38。《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)规定的预增菌时间为8~18 h。因此,增加缓冲蛋白胨水培养基中酵母浸膏的添加量可以使菌悬液提前达到所需的OD550值,从而缩短前增菌时间。

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