微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量的研究

作者: 周培华 刘兰 钟文涛 杨滔 周兴旺 袁列江

微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量的研究0

摘 要:目的:建立一种准确、高效的糖蜜含糖量检测方法,弥补该领域的空白,规范糖蜜市场,为以糖蜜为原料的发酵生产企业提供低成本检测糖蜜含糖量的检验方法和思路。方法:同时使用新构建的微生物发酵联用折光仪和多糖检测试剂盒法检测,比较两者偏差值;采用葡萄糖加标回收、非糖可溶性固形物干粉VINASE添加考察新建方法的准确性和可靠性。结果:以酿酒酵母、嗜渗酵母为发酵菌株实验组,以嗜渗酵母为发酵菌株实验结果更优,偏差范围在-1.50%~2.00%,平均绝对偏差为0.46%;葡萄糖加标回收实验,0.5 g实验组回收率在84.0%~106.0%,平均回收率高达90.8%;2.0 g实验组回收率在94.8%~105.2%,平均回收率高达100.5%;VINASE实验组,0.5 g实验组偏差在-2.4%~1.1%,平均绝对偏差仅为0.4%;2.0 g实验组偏差在-3.5%~1.7%,平均绝对偏差仅为-1.1%;对比多糖检测试剂盒法,微生物发酵联用折光仪法对核心设备及试剂几乎无特别要求,不依赖于进口试剂。结论:新建立的微生物发酵联用折光仪法相比传统多糖检测试剂盒法,是一种成本极低、效率较高的糖蜜含糖量检测方法,具有优异的准确性、稳定性,检测门槛低,可被广泛应用于糖蜜生产、交易、加工行业。

关键词:微生物发酵;折光仪;糖蜜;含糖量检测

Microbial Fermentation Combined with Refractometer Study on the Detection of Sugar Content in Molasses

ZHOU Peihua, LIU Lan*, ZHONG Wentao, YANG Tao, ZHOU Xingwang, YUAN Liejiang

(Hunan Provincial Institute of Product and Goods Quality Inspection, Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning, Changsha 410117, China)

Abstract: Objective: To establish an accurate and efficient molasses sugar content detection method, to fill the gaps in this field, to standardize the molasses market, and to provide testing methods and ideas that can detect the sugar content of molasses at low cost for fermentation production enterprises using molasses as raw materials. Method: The newly constructed microbial fermentation combined refractometer and polysaccharide kit were used to detect the deviation between the two methods. The accuracy and reliability of the new method were evaluated by glucose standard recovery and non-sugar soluble solid dry VINASE addition. Result: Saccharomyces cerevisiae and lyophilic yeast were used as fermentation strains in the experimental group, and lyophilic yeast was used as fermentation strain. The experimental results were better, with the deviation ranging from -1.50%~2.00%, and the average absolute deviation was 0.46%. In the glucose spiked recovery experiment, the recovery rate of 0.5g group was 84.0%~106.0%, and the average recovery rate was up to 90.8%. The recoveries of 2.0 g group were 94.8%~105.2%, and the average recoveries were 100.5%. In VINASE group, the deviation of 0.5 g group was between -2.4%~1.1%, and the average absolute deviation was only 0.4%. The deviation of 2.0 g experimental group was between -3.5%~1.7%, and the average absolute deviation was only -1.1%. Compared with polysaccharide detection kit method, microbial fermentation combined refractometer method has almost no special requirements for core equipment and reagents, and does not rely on imported reagents. Conclusion: Compared with traditional polysaccharide detection kit method, the newly established microbial fermentation combined refractometer method is a very low test cost and high-efficiency method for the detection of sugar content in molasses, with excellent accuracy, stability and low detection threshold, can be widely used in molasses production, trading and processing industries.

Keywords: microbial fermentation; refractometer; molasses sugar; content detection

糖蜜是制糖过程中,糖液经浓缩析出结晶糖后残留的棕褐色黏稠液体。在我国的微生物发酵工业尚不成熟前,曾一直被当作制糖业的废弃物,给环境造成了较为严重的污染。糖蜜的成分复杂,其最主要的营养成分是糖,含糖量在40%~80%,多为聚合度不等的多元糖和一定数量的单糖,此外还含有较丰富的维生素、植物蛋白氨基酸、果胶等[1-2]。

如今,糖蜜的废物利用已形成较为完善的工业加工体系,作为一种重要的食品工业发酵原料进入市场,并被广泛应用于酿酒酵母、面包酵母发酵生产乙醇、丁醇、氨基酸多肽、虾青素和单细胞蛋白饲料等食品发酵相关行业[3-7]。由于其营养较丰富且价格相对廉价,因此糖蜜作为食品工业原料常呈现供不应求的状态。据统计,2021年国内全年糖蜜生产交易量为3 863万t,此外还有进口糖蜜1 209万t,价格从2015年的800元/t左右逐年上升,截止到2021年9月平均价格为1 100元/t[8]。

目前,在糖蜜市场的交易中用以衡量糖蜜品质的核心指标是其含糖量的多少。由于糖蜜交易极为频繁,因此要求检测过程快速、高效。但常规的含糖量检测周期太长,且由于糖蜜中的糖分多为混合糖类,聚合单元繁杂,不太适合使用常规的含糖量检测方法,因此目前在糖蜜交易过程中依然采用最简单、粗放的折光仪检测[9]。折光仪的本质是检测可溶性固形物含量,只适用于成分较为单一的糖液含糖量检测评判,而糖蜜中的其他多种物质对固形物含量都有影响,因此采用折光仪检测含糖量偏差非常大。一些不规范的糖厂及中间商在糖蜜中加入非糖类的可溶性固形物,以次充好,极大地扰乱了糖蜜市场,对下游的食品发酵工业领域造成较大的经济损失和工艺负担。此外,食品发酵企业为了对发酵生产进行工艺设计和计算,需准确测量糖蜜的含糖量。目前,在以糖蜜为原料进行生产高附加值产品的企业大都采用生物酶总糖检测试剂盒,该试剂盒采用进口酶制剂将聚合度不同的糖水解为葡萄糖,再用紫外吸光光度法检测葡萄糖进而得到糖蜜的含糖量。该方法检测成本较高,生产企业一般无法承受对来源不同、批次不一的糖蜜进行频繁检测,因此只能进行代表性地抽检,给发酵工业和工艺带来了很多不确定性,给生产和品质造成了很大影响。个别实验室依然采用传统的硫酸蒽酮法检测糖蜜含糖量,但是此方法的本质是检测总碳水化合物,在检测糖蜜这种含有果胶成分的混合物时会出现较大偏差,且使用浓硫酸碳化样本,全程需要在沸水和冰冻环境中切换操作,不仅危险而且极为烦琐[10]。

针对目前尚没有一种高效、准确的糖蜜含糖量检测方法,本文通过对糖蜜含糖量检测的分析和研究,采用微生物发酵和折光仪联用的方法检测糖蜜的含糖量,准确且高效,以期规范糖蜜的品质衡量指标,改变目前糖蜜市场的混乱局面,也为以糖蜜为原料的发酵生产企业降低检测成本提供方法和思路,从而保证相关工艺优化和产品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母(高糖)(广西丹宝利酵母有限公司);嗜渗酵母CICC32788(中国工业微生物菌种保藏管理中心);PDA琼脂培养基、BHI脑心肉汤培养基、葡萄糖(北京陆桥);多糖检测试剂盒(德国拜发EnzyTECtm);糖蜜(市购样品);VINASE干粉(市购)。

1.2 仪器与设备

PAL-1/2折光仪(日本ATAGO);SPS401F电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司];MIR-154-PC恒温培养箱(日本Panasonic);T9紫外可见光分光光度计(北京普析);101-3AB干燥箱(天津泰斯特);5804R台式高速冷冻离心机(德国EPPENDORF);HWS-28水浴锅(上海一恒);C-MAGHS7加热磁力搅拌器(德国IKA)。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准溶液配制

取适量葡萄糖,于100 ℃±2 ℃减压干燥箱内烘至恒重。

葡萄糖标准储备液:精密称取烘干后的葡萄糖100.00 mg,置于10 mL容量瓶中,用纯水溶解并稀释至10 mL,摇匀,制成浓度为10.00 mg/mL的标准贮备液,4 ℃保存。

葡萄糖标准工作液:分别准确量取10.00 mg/mL的标准储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL至10 mL容量瓶并定容至10 mL,浓度依次为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL和10.0 mg/mL,临用新配。

1.3.2 菌株活化菌悬液制作

将酿酒酵母干粉0.010 0 g使用无菌水10.0 mL溶解后划线至PDA平板,挑取较大单菌落接种至BHI肉汤,36 ℃培养24 h,8 000 r/min离心5 min去除上清液,加入30%(W/W)灭菌甘油溶液混匀,分装并冻存。临用时常温解冻,8 000 r/min离心2 min去除上清液,加入灭菌生理盐水摇匀备用。

1.3.3 糖蜜前处理

称取糖蜜原液5 g,加入纯水45 mL稀释摇匀,5 000 r/min离心2 min除泥,留取上清液S作为糖蜜待检样。

1.3.4 试剂盒检测糖蜜含糖量

取德国拜发EnzyTECtm多糖检测试剂盒,每5 mL待测样品加入5 mL酶解液,65 ℃酶解6 h;加入着色试剂0.2 mL,85 ℃着色30 min,于505 nm处检测吸光值,根据葡萄糖标准曲线方程计算糖蜜含糖量。

1.3.5 微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量

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