高通量基因测序技术将如何在食品微生物鉴定和溯源领域持续发力？看看专家怎么说

微生物种类繁多，并在自然界中广泛存在，其既可以起到有益作用，也可能给人类带来危害。微生物引起的食品危害主要是食品的腐败变质，使食品的营养价值降低或完全丧失。其中，随着食品生产规模的扩大和食品贸易的国际化，食源性致病微生物的控制面临严峻挑战——食源性致病微生物导致的全球食品安全问题不断发生。例如，单增李斯特菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌和阪崎克罗诺杆菌等广泛存在，且与疾病暴发密切相关。

为有效管控食品中的致病微生物，我国制定了《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》（GB 14881—2013）。其中提到，食品加工过程中的微生物监控是确保食品安全的重要手段，是验证或评估目标微生物控制程序有效性，以及确保整个食品质量和安全体系持续改进的工具。

由此看来，食品微生物检验是衡量食品安全质量的重要指标，也是判断食品加工环境及食品卫生情况的重要手段。然而，普通检测手段往往仅能检测食品中微生物的种类和数量，并不能进行追根溯源。因此，高效准确、信息容量大的高通量基因测序技术在近几年被逐渐应用到食品微生物检验领域，其可在信息缺乏或多种微生物存在的情况下对食源性致病微生物进行溯源和分析，以此为食源性微生物疾病预防和控制提供重要的依据。为了解高通量基因测序技术这一高精尖技术的发展，详细分析该技术在食品微生物领域的应用，《食品安全导刊》杂志特设“高通量基因测序技术用于食品微生物鉴定和溯源”专题，邀请专家进行深入探讨，来看看他们都说了些什么吧。

问：高通量基因测序技术在医学领域已经得到长足发展，但其在食品领域的应用是怎样的？能否谈谈高通量基因测序技术的前世今生？

曾静：高通量基因测序技术又称下一代测序技术（NGS）。相对于一代测序技术，高通量测序技术具有准确、灵活、高通量及单碱基成本低等优势。在微生物高通量测序中，全基因组测序技术应用较为广泛，它能检测样品中各遗传物质的相关性，从而追溯致病菌暴发源头，因此很快在食品领域得到了广泛的应用，为各类食源性致病菌的遗传系统发育树构建、致病机理的理解和微生物溯源提供支持。

谈及高通量基因测序技术的发展历程，从1990年正式启动“人类基因组计划”直到2020年，这这30年的时间里，测序技术拥有17个里程碑式的成果，如2008年癌症相关的基因测序揭示了基因突变与癌症的相关性等；这30年也是测序技术飞速发展的时期，特别是在医学领域，其已经用于癌症的预测与治疗，并给无数患者带来生的希望。

测序技术在医学领域的应用也带动了其在微生物领域的发展应用。2008年，美国食品药品监督管理局（FDA）启动了国家微生物全基因组计划；2012年，FDA和美国疾病控制与预防中心（CDC）宣布启动“10万基因组计划”，即对约10万种重要的食品来源的致病菌（包括沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌等重要致病菌）进行测序，并将测序信息储存在国家生物技术信息中心（NCBI）的公共数据库；2014年，美国CDC启动了基于全基因组测序技术的高级生物学检测项目，并宣布在2018年将全基因组测序技术用于单核细胞增生李斯特氏菌的分子分型，以便快速准确地锁定病因食品；2015年，欧盟食品安全局（EFSA）将全基因组测序技术用于食品中重要食源性致病菌的鉴定、分子分型、耐药、血清分型等。

在我国，中科院微生物所于2018年牵头组织发起了全球模式微生物基因组测序计划——从全球微生物资源保藏中心选择目前未进行测序的模式微生物菌株（包括细菌、古细菌和可培养真菌），5年内完成超过10 000种的细菌、真菌、古菌模式菌株基因组测序，建立全球微生物模式菌株基因组测序合作网络；2013年，国家食品安全风险评估中心（CFSA）首次在国内采用全基因组测序技术处理新西兰恒天然婴儿配方食品污染可疑肉毒梭菌的食品安全应急事件；2015年，国家食品安全风险评估中心启动了《国家食源性致病微生物全基因组测序数据库》的构建工作，致力于病因食品的快速准确识别。

问：据了解，高通量测序技术在我国食品微生物领域的应用还停留在科学研究和数据库构建阶段，尚未在食品微生物检测实验室得到普及。那么，国家出台了哪些政策与法规来助推和规范该技术的发展？

姜毓君：目前，我国关于高通量基因测序技术在微生物检测领域的应用已经发布了系列标准，如《环境微生物宏基因组检测 高通量测序法》（GB/T 40226—2021）、《高通量基因测序技术规程》（GB/T 30989—

2014）及《用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范》

（GB/T 40458—2021）。此外，我国也设定了全球首个针对基因测序仪的行业标准——《高通量测序仪标准》（YY/T 1723—2020）。以上种种，均体现了我国在高通量基因测序领域的前瞻性和先进性。

杜欣军：《高通量基因测序技术规程》（GB/T 30989—2014）适用于对动物组织、血液、粪便、口腔黏膜、毛发、植物组织、土壤、微生物等生物样品进行检测。该标准详细规定了高通量基因测序相关的指标要求及条件，如测序通量、碱基识别正确率、碱基识别质量、主要仪器设备要求、测序设备推荐使用条件、实验室条件、试剂及溶液配制要求、测序过程等内容。

目前，在流行病调查、病原溯源方面，国家市场监督管理总局、疾控中心、卫生健康委员会等职能部门已经使用高通量测序技术对微生物进行监控。国家“十三五”重点研发计划设立的一些项目就包括针对微生物高通量测序、数据库建立、溯源平台与风险评估进行的研究，并已取得了不错的进展。相信，在这些项目的支撑下，高通量测序技术的应用将来会越来越成熟、越来越规范，也将在流行病控制、食品安全保障方面发挥更大的作用。此外，《2035年远景目标纲要》提出，围绕基因与生物技术，加快基因组学研究应用，加快体外诊断研发；《“十四五”生物经济发展规划》也在推动基因检测、生物遗传等先进技术与疾病预防的深度融合。

问：为什么要对食品中的微生物进行鉴定和溯源？在什么情况下需要进行这一操作？

白莉：食源性疾病是全球面临的重大公共卫生问题，频发的食源性疾病事件不仅危害人类健康，也会造成严重的经济损失。在食品产业高度工业化的国家，一家公司生产的食品可快速销往全国或全球，致使食源性疾病暴发呈现跨国界、跨区域、进展快、难预测等特点，如2011年德国产志贺毒素大肠埃希菌O104：H4污染芽苗菜和2017年南非单核细胞增生李斯特菌污染肉制品引起的暴发事件等。如何从散发病例的复杂食物暴露中快速识别病因食品的关联性，进而确定暴发事件并迅速采取有效的处置措施是各国食源性监测体系面临的挑战。

美国是最早建立食源性疾病暴发主动监测系统的国家，美国CDC逐步建立基于实验室的食源性疾病分子溯源网络（PulseNet），其在食源性疾病的暴发识别、调查、溯源、预警及疾病负担研究中得到成功应用。欧盟也设有与美国相类似的监测系统，其也在食源性暴发事件中发挥着快速识别及预警作用。近期全球多国报告单相鼠伤寒沙门菌污染巧克力产品事件就是最好的实例。2022年3月27日，英国卫生安全局（UK Health Security Agency，UKHSA）向世界卫生组织（World Health Organization，WHO）通报了一组由来源不明的序列型（sequence typing，ST）34型单相鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium 4，[5]，12：i：-）引发的聚集性病例，随后欧洲多个国家陆续报告了相关病例。通过流行病暴发溯源调查，应用全基因组测序技术确定了A公司在比利时工厂B生产的巧克力产品为病因食品。对涉事企业调查发现，是两株单相鼠伤寒沙门菌导致此次暴发事件。

董庆利：由于食品风险环节复杂多变，故仅检测某厂家或某批次食品中是否有特定微生物的效果微乎其微，只有通过溯源技术对所分离的微生物进行特征分析，揭示其可能来源，识别可能的传播途径，进而制定相应的防控措施，才能有效管控污染来源。典型应用场景如下。

第一，食品及环境中微生物多样性及溯源研究。对生产过程中车间人员手部和设备表面进行微生物污染调查。从样本中分离菌株，得到各类微生物的相对丰度，即多样性；若通过构建系统发育树发现同种微生物高度相关，则推测人员手部与设备表面存在交叉污染；若物料容器中多次分离出某菌，则提示容器是污染源之一。

第二，常见食源性致病菌风险分析。研究泡菜发酵操作与其中致病菌检出间的关联性，分析泡菜中致病菌存在的风险。如家庭泡菜易出现肠杆菌属和假单胞菌属，工业泡菜中李斯特菌属出现机率较大，发酵时间与葡萄球菌属和李斯特菌属出现概率呈正相关。

问：目前，国内外进行食源性致病微生物鉴定与溯源的水平如何？

白莉：随着新一代测序技术的发展，基于全基因组测序的分子分型技术在食源性疾病聚集性病例识别和暴发溯源调查中已显示出极大的应用价值和发展潜力，并逐渐成为国际研究热点，欧美相关国家已相继开展研究和布局。

在欧美等国，因全基因组测序技术具有更高的分辨率，已逐步取代传统的分型方法，如PFGE、MLVA和MLST，并用于一系列高优先级的食源性致病菌。比如，美国CDC于2013年开始使用该技术监测单核细胞增生李斯特菌，到2019年全面取代PFGE成为识别和监测的金标准，并用于非伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、弯曲菌和产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）的监测。

目前，我国食源性疾病监测报告系统中每年报告近万起暴发事件，识别的事件多暴发在同一就餐地点（家庭、宾馆）或集中供餐场所（学校），跨区域的暴发较少。虽然我国已建立基于流行病学调查和实验室确证（PFGE/WGS）食源性疾病暴发监测体系，但在快速识别方面仍存在一定的不足。如何快速识别未知病因食品的关联散发病例，并在短时间内确认为暴发事件，及时发布风险预警来降低食源性疾病风险，是下一步工作中需要直面的挑战性课题。美国食源性暴发识别系统从消费者暴露病因食品、发病后就医（第1～5天），到临床样本分离株在公共卫生实验室完成全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和其他检测上传至PulseNet（第16～22天），再到美国CDC基于数据库中病例信息的比对识别确定关联病例并确定是否为暴发事件（第23天），只需3～4周的时间。确定为暴发事件后，公共卫生和监管机构将联合启动暴发调查，收集流行病学和卫生学调查、临床和实验室检验资料；当明确食源性疾病暴发的病因食品后，政府会立刻向公众发出警示并召回食品。借鉴美国CDC和ECDC应对此类暴发的成熟体系和措施，基于我国现有食源性疾病暴发监测体系，完善处置过程不同环节（疾控、监督、哨点医院）的职责和衔接，加强流行病学数据和菌株信息共享，提高监测数据分析及预警能力，从技术层面上提升此类事件应急管控措施的时效性，有助于为政府食品安全管理部门的快速决策提供科学依据，实现食品安全防控从被动应付向主动防控的战略转变，进而提高公共安全防控水平。

董庆利：进入“十三五”以来，国内对微生物全基因组测序技术已经取得共识，但需要迅速将该技术普及并用于食源性致病菌鉴定、分型及溯源。传统的食源性疾病暴发中，病原菌的确认通常需要几周或更长时间，全基因组测序技术可在几天内确定致病菌——及时控制并召回病因食品，并为有效诊治患者提供强有力的技术支持。另外，宏基因组测序及宏转录组测序技术目前在国内和国际社会呈快速发展势头。随着微生物组学的发展和配套生物信息方法学技术的进一步开发，下一代测序也将成为食源性致病菌基因组数据平台中不可或缺的一部分。希望在不久的将来，下一代测序技术能与更多新兴方法相结合，使其不仅应用于食源性致病菌的检测识别及溯源，还能为推动食品安全事业发展作出贡献。

问：您所在的单位是否会用到高通量测序技术？其主要用于哪方面的研究？在此过程中，该技术帮助贵单位取得了怎样的成果？