液质串联测银耳及其银耳制品中米酵菌酸含量

米酵菌酸（Bongkrekic acid，简称BA），分子式C28H38O7，是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种会引起食物中毒的毒素。2012年，山东省临沂市发生了一起食物中毒事件，患者表现为恶心、呕吐、乏力、精神不振等症状，随后在剩余的银耳中检测到了米酵菌酸。米酵菌酸具有很强的生物活性，高温不易杀死，且易吸附于活性炭，是会导致银耳中毒的病原菌产生的毒素之一。米酵菌酸有脂溶性，易溶解于乙腈、甲醇等有机溶剂。我国现行的标准《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》（GB 5009.189-2016）中规定使用高效液相色谱法，但前处理中的液液萃取法较为复杂，消耗时间太长，且三氯甲烷具有毒性，不利于实验室检测。目前，虽然出现了超高效液相色谱串联质谱法的新方法，但尚未有相关文献对银耳基质进行较为简单的检测。因此，本文探索使用LC-MS测定银耳（干制品）中的米酵菌酸含量，以期获得简便、灵敏、快速、可靠、重现性好，能用于银耳及其银耳制品中米酵菌酸检测的方法。

1.1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器与器材

Agilent1290-6470三重四极杆液相质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；AllegraX-15R离心机，美国贝克曼公司；YB-502N电子天平，上海海康电子仪器厂；VXR振荡器，IKA公司；50mL的FALCON离心管；有机系0.22μm滤膜。

1.1.2试剂

乙腈（色谱纯）OMNI（批号：230101011M04）；氯化钠（分析纯）天津市光复科技发展有限公司（批号：20180113）；盐酸（分析纯）西陇科学股份有限公司（批号：200720）；米酵菌酸TMstandard（含量：97.5%）（批号：722206-100μg/G23080131）。

1.1.3标准溶液配制

米酵菌酸标准储备液：准确称取5.128mg米酵菌酸标准品，加乙腈溶解并定容至100mL，此时，米酵菌酸浓度为50μg/mL。

1.1.4色谱条件

仪器：三重四级杆液相质谱联用仪Agilent1290-6470；色谱柱：ACE C18-AR 50×2.1mm；流动相：A相—乙腈；B相—蒸馏水。梯度洗脱程序：前0.5分钟20%A，0.5到1.50分钟A由20%变成80%，1.5到2.00分钟80%A；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：2.00μL。

1.1.5质谱条件

检测方式MRM；离子源AJS ESI－；雾化器压力25psi；干燥器温度150℃；干燥器流速18L/min；毛细管电压3000V；鞘气温度150℃；鞘气流速12L/min；加速电压3V；母离子（m/z）：485.6；子离子（m/z）：441.1（定量离子）/397.3/321.2/153.0；裂解电压/V：130/130/130/130；碰撞能量/V：13/13/25/35。

1.2方法

1.2.1样品前处理

1.2.1.1采用GB 5009.189-2016中的液液萃取法

前处理：称取20g（精确至0.01g）置于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，室温下避光浸泡1h，再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液（45.4%）。将上述滤液分别移入150mL分液漏斗中，加入与滤液等体积的碳酸氢钠溶液（40g/L），振摇2min，静置待分层后，取出下层于另一分液漏斗中；接着，用碳酸氢钠溶液（40g/L）10mL重复提取两次，轻摇；将三次提取的碳酸氢钠溶液合并，加入25mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层后弃去三氯甲烷，于分液漏斗中慢慢加入盐酸溶液（6mol/L）调该溶液pH至2-3，之后加入石油醚50mL，振摇3min，静置分层，取出石油醚层于旋蒸瓶中，再分别用石油醚30mL和20mL各提取一次，将石油醚层并入同一瓶中，于40℃±0.5℃水浴中旋蒸浓缩至干，接着用少量甲醇分次将旋蒸瓶中的提取物溶解并转移至5.0mL的玻璃离心管或浓缩瓶中，于40℃±0.5℃下氮吹浓缩至干，最后加入0.5mL甲醇，涡旋溶解，混匀，经微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。方法检出限为0.005μg/g，定量限为0.015μg/g。

1.2.1.2改进方法

前处理：精确称取20.00g（精确至0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中，加入20mL乙腈，室温下避光浸泡1h，加入0.1mL盐酸，3.00g氯化钠，使用振荡器振摇5.5min，静置，接着以7500r/min离心6min，取适量上清液经0.22μm有机系滤膜过滤，待三重四级杆液相质谱联用仪Agilent1290-6470测定，色谱及质谱条件如1.1.4、1.1.5设定。

1.2.2配制标准曲线系列溶液

分别称取25.0μL、50.0μL、100.0μL、250μL、500μL米酵菌酸标准储备液（50μg/mL）于5mL容量瓶中，加乙腈稀释并定容至5.00mL，此时，米酵菌酸浓度为0.25μL/mL、0.50μL/mL、1.00μL/mL、2.50μL/mL、5.00μL/mL。

1.2.3样品的测定

按照国标方法：取街市上购买的银耳（干制品）3批，编号为T1-1、T2-1、T3-1，按照GB 5009.189-2016测定，结果显示均未检出。

按照改进方法：取街市上购买的银耳（干制品）（厂家与国标方法的厂家一致）3批，编号为T1-2、T2-2、T3-2，按照改进方法进行提取测定，结果显示均未检出。

2.结果与分析

2.1前处理方法的优化

与国标方法相比，本实验的实验步骤较为简单，方便操作，耗时短，能显著提高实验效率。使用国标方法检测时，银耳（干制品）浸泡后基质过于粘稠，在净化的步骤中经过多次稀释，仍无法通过柱子，耗时长，效率低。在改进方法中，用乙腈作为萃取剂，可以直接将米酵菌酸目标物提取出来到乙腈层，省略国标中过柱子的烦琐过程，大大节约检测时间。

2.2线性

取米酵菌酸标准溶液系列，在上述色谱-质谱条件下进行检测分析，作米酵菌酸浓度-响应值的标准曲线，同时，以响应值Y为纵坐标，以标准溶液浓度C（μg/mL）为横坐标作线性回归，得到如下回归方程：Y=252711X-54963，R2=0.9962。因此，米酵菌酸的浓度在0.25-5.00μg/mL浓度范围内，线性关系良好，标准曲线见图1。

2.3检出限

称取5g已知不含米酵菌酸的银耳（干制品）空白样品，精密吸取160.0μL米酵菌酸标准液S2（0.50μg/mL）按照1.2.1.2的改进方法进行试验，同时按照上述色谱-质谱条件进行测定，将3倍信噪比（S/N=3）作为检出限的最低响应值，由仪器得出的信噪比为7.2，可以满足检测要求。该条件下的检出限为0.004μg/g，可以满足国标方法检出限0.005μg/g的要求。

2.4仪器精密度

取浓度为5.00μg/mL的米酵菌酸标准溶液，连续进样5次，响应值分别为1208108.780、1214873.017、1198420.799、1208523.953、1203241.138，RSD为0.5%，由此可见，该仪器的准确性较高。

2.5重复性试验

重复性试验采用标准加入法，在已知不含米酵菌酸含量的6份银耳（干制品）（20g）中分别加入200.0μL米酵菌酸标准储备液（50μg/mL），按1.2.1.2的前处理方法进行提取，此时样品中含米酵菌酸0.50μg/mL，接着以1.1.4和1.1.5的色谱-质谱条件进行米酵菌酸的测定。结果显示，6份试样中米酵菌酸的最终浓度平均值为0.5033，其相对标准偏差RSD为0.5%。由此可见，本检测方法稳定可行、重复性好，具体结果见表1。

2.6回收率试验

在已知不含米酵菌酸含量的样品中采用标准加入法，称取9份银耳（干制品）试样各20g，将9份试样分成低（编号：A-1，A-2，A-3）、中（编号：B-1，B-2，B-3）、高（编号：C-1，C-2，C-3）三个水平，分别加入120.0μL、360μL、1200μL的米酵菌酸标准储备液（50μg/mL），按照1.2.1.2的操作进行实验，然后在上述1.1.4和1.1.5的液相-质谱条件下测定米酵菌酸的含量，同时按外标法进行定量，计算加标回收率。最终数据表明，此方法的加标回收率在98.4%-102.9%之间，相对标准偏差（RSD）在0.6%-0.8%之间，这说明此检测方法可行，检测结果可靠，具体结果见表2。

2.7稳定性试验

称取不含米酵菌酸含量的样品20g，加入120.0μL米酵菌酸标准储备液（50μg/mL），按照1.2.1.2的操作进行实验，同时在1.0h、4.0h、8.0h三个不同的时间间隔点按1.1.4和1.1.5的液相-质谱条件测定米酵菌酸的含量。结果显示，1h、4h、8h后的测得值分别为0.3002μg/mL、0.2998μg/mL、0.2996μg/mL，相应的相对偏差（RAD）为0.07%、0.04%、0.10%，这说明此检测方法稳定性好，检测结果可靠。

2.8空白试验

空白试验是在不加入样品的情况下按1.2.1.2处理。结果显示未检出且在出峰时间段基线平衡，这说明空白对本试验不会造成影响。

结论

银耳（干制品）作为日常食品，对于采用控制产品质量的定量分析的简便方法十分有必要，而银耳（干制品）使用国标方法浸泡后，基质过于黏稠，多次稀释仍无法过滤且耗时长，因此，本研究采取了测定银耳（干制品）中米酵菌酸含量的快速检测方法。本改进方法在试验时，不受银耳浸泡后基质过于黏稠的影响。在改进方法中，使用氯化钠降低米酵菌酸在水中的溶解度，使乙腈和水分层，然后用盐酸使样品溶液酸化，以乙腈作为萃取溶剂。结果数据表明，本文方法在0.25-5.00μg/mL的标准溶液浓度范围内，线性关系呈良好，相关系数R为0.998，回收率在98.4%-102.9之间，回收率的RSD在0.6%-0.8%之间，稳定性试验的RAD在0.07%-0.10%之间，重复性试验的RSD为0.5%。同时，本方法的检出限为0.004μg/g，符合国标要求。由此可见，本方法有较高的精确度和可靠性。