4种乳菇属真菌的形态学与rDNA-ITS鉴定

摘    要：为明确内蒙古赤峰地区常见有毒乳菇种类，准确、快速地识别有毒乳菇，将采集的4个乳菇属Lactarius真菌标本采用传统形态学分类方法进行鉴定，同时提取子实体DNA，使用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，用Blast对扩增产物纯化测序所得的序列进行比对，采用MEGA5.1软件构建系统发育树确定属和种。结果表明，2种方法鉴定结果一致，标本CFSZ10167为毛头乳菇[Lactarius torminosus （Schaeff.）Pers.]，标本CFSZ10216为绒边乳菇[Lactarius pubescens（Fr. ex Kronbh.）Fr.]，标本CFSZ13021为灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.）Fr.]，3种均为胃肠炎型毒菌，CFSZ10044为皱乳菇（Lactarius ruginosus   Romagn），为中国新记录种，主要特点是菌盖棕褐色、浅褐色，有绒质感，盖缘呈齿状，孢子球形具小刺，食毒不明。对4个种的形态学特征进行了详细描述，并附有生境图片和显微图像，研究结果为乳菇属物种鉴定和资源分布提供了重要补充，并为常见毒菌识别提供了理论依据。

关键词：乳菇属；毒菌；形态学；rDNA-ITS测序鉴定；系统发育树

中图分类号：Q939.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-056-08

Morphologal and rDNA-ITS identification of four fungi in Lactarius

TIAN Huimin， LI Jiang

（College of Chemical and Life Science， Chifeng University， Chifeng 024000， Inner Mongolia， China ）

Abstract： Four unkown poisonous mushrooms of Lactarius from the city of Chifeng in Inner Mongolia were collected and identified by morphology classification to identify the genera and species， the fungal DNA were extracted from the fruiting bodies， amplified by PCR using fungal universal primers ITS1/ITS4， the sequences obtained from purification and sequencing of amplification products were compared by blast， a phylogenetic tree was constructed using MEGA5.1 software to identify the genera and species as auxiliary mean. The results of the two methods are consistent， Specimen CFSZ 10167， CFSZ10216 and CFSZ13021 are  Lactarius torminosus（Schaeff.） Pers.， Lactarius pubescens（Fr. Ex Kronbh.）Fr. and Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr. respectively， which are all gastroenteritis poisonous mushrooms， CFSZ10044 is Lactarius ruginosus Romagn， new to China. The main features include that the cap is tan or light brown， with a velvety texture and toothed margin， the spores are spherical with small spines， edible or poisonous unkown. The morphological characteristics of the four species were described in detail， and the habitat picture and micrograph were attached， and the result provided an important supplement to the species identification and resource distribution of Lactarius and a theoretical basis for the identification of common poisonous fungus.

Key words： Species of Lactarius; Poisonous fungi; Morphology; rDNA-ITS sequencing; Phylogenetic tree

毒菌亦称毒蕈、毒蘑菇，是指大型真菌的子实体食用后对人或畜禽产生中毒反应的物种，绝大部分属于伞菌，少部分为子囊菌[1]。有些毒菌与野生食用菌的外形特征极其相似，因此很容易混淆被误食而引起人畜中毒。据2014年统计，我国毒菌有435种[2]，分布在全国各地；每年都会发生毒菌引起的中毒事件，其中23个省份报道过此类事件，毒菌中毒是我国食物中毒致死事件的主因，致死率较高[3]。乳菇属（Lactarius）是常见的毒菌类群之一，该属的许多种真菌含有胃肠道毒素，引起肠胃炎反应[4-5]。而且有的种能富集重金属如铬、铜、铯、铅，易引起重金属中毒[6-7]。乳菇属主要的识别特征是子实体肉质，菌盖半球形，中央下凹、有时呈漏斗状，颜色多样，表面具绒毛或无，具同心环纹或无；菌褶新鲜受伤时往往有乳汁流出；担孢子在显微镜下无色至淡黄色，通常为球形至宽椭圆形，有小疣或小刺，常具有囊状体，许多种具有油囊体或乳汁管 [8]。菌盖、菌柄和菌褶的菌肉组织具球状细胞。该属真菌通常生于白桦林、蒙古栎、杨树林等阔叶林和油松、樟子松等针叶林内，与植物形成共生菌根，分布范围广，海拔低，是当地村民经常采集的一类真菌。乳菇属真菌的鉴定主要靠形态学特征，但是在地理环境、气候和营养条件的影响下，子实体颜色和大小都有一定的变化，给鉴定带来一定的困难。

近些年来基于核糖体DNA基因转录间隔区（rDNA-ITS）的聚合酶链式反应（PCR）扩增测序技术如内转录间隔区序列（ITS）、核糖体大亚基序列测序（nLSU）和核糖体大亚基序列测序（SSU）[9]、线粒体基因组、全基因组[10-12]等多种分子技术应用于乳菇属真菌鉴定和亲缘关系分析研究，大大提升了该科真菌的鉴定效率和准确度。然而，DNA证据并不总是与形态证据吻合，这又为食用菌和毒菌的识别和名称的使用带来了困扰和不便[13]。笔者在传统的形态鉴定基础上，利用rDNA-ITS对几种常见的乳菇属真菌进行鉴定，并附彩色图片，为毒菌的准确识别鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216于2013年8月12日采自内蒙古自治区赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区。CFSZ13021标本于2016年8月11日采集于内蒙古自治区赤峰市松山区城子乡盔甲山。所有标本拍摄生境照片后，测量子实体菌盖直径、菌柄长度和直径；观察新鲜子实体菌盖、菌柄颜色、附属物，菌褶颜色、乳汁颜色；采集、编号、晒干、装袋，带回实验室，经-80 ℃超低温冰箱（906GP-ULTS，塞默飞世尔科技有限公司）冷冻2周后，室温保存于赤峰学院化学与生命科学学院菌物标本室（CFSZ）。于2014年6月10日进行标本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216的形态学鉴定，2015年2月15日进行分子鉴定。于2016年11月1日进行CFSZ13021标本的形态学鉴定，2017年4月27日进行分子鉴定。

1.2 形态鉴定

采用宏观特征、显微结构与化学试剂反应相结合的鉴定方法。颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片，选1～5个新鲜子实体，用游标卡尺测量其大小，观察颜色、形状、附属物等，菌褶颜色及变化、着生方式，菌肉颜色和气味等特征，显微观察在光学显微镜40倍镜下（奥特B203LED，爱迪泰克科技有限公司）完成，通常取小块菌褶、菌盖和菌柄表皮以4%～5%氢氧化钾作浮载剂制成徒手切片，担孢子以随机测量30个为准，菌丝、囊状体、担子等测量15～20个，测量长和宽范围，宽度测量以最宽处为准。孢子、菌丝、囊状体、担子等淀粉质反应是将梅尔泽试剂（Melzer’s reagent）加入到浮载剂中显色来判断，具体鉴定方法参照田慧敏等[14]的报道。

1.3 rDNA-ITS测序鉴定及系统发育树的构建

取子实体干品一小部分菌盖（含菌褶）用研钵研磨成粉末状，称取30 mg粉末，用DNA提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司）提取基因组DNA。参照White等 [15]以ITS1/ITS4为正反向引物进行PCR扩增反应，将已测得的ITS序列提交至NCBI的GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）检索相似序列，用MEGA5.1软件中的Alignment程序对检索的相似序列和标本序列进行多重对位排比，并采用Analysis程序Kimura 2-parameter模式计算遗传距离，Bootstrap循环1000次，采用最大似然法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态结构特征

2.1.1 毛头乳菇[Lactarius torminosus（Schaeff.）Pers.] 子实体中等大，菌盖直径3～6 cm，漏斗形，表面浅肉桂色，中央呈深褐色，具红棕色同心环纹，表面具平伏状绒毛，边缘内卷具粗毛或刺毛（图1-A～B）；菌肉白色，厚，伤不变色；菌褶乳白色或米色，干后米黄色，等长，较密，从盖缘发出短菌褶，伤后流出白色乳汁，后变褐色，味道辣；菌柄大小（5.2～8.4） cm×（1.2～1.5） cm，圆柱形，基部较细，中空，色同菌盖呈肉桂色，基部白色。

担孢子大小为（7.2～9.7） µm×（6.5～8.6） µm，无色，宽椭圆形，有小刺（图1-C）； 担子大小为（34.0～57.6） µm×（7.5～12.0） µm，棒状、具4个小梗、无色（图1-D）；褶侧囊体少，（52.0～70.0） µm×（9.0～12.0） µm，披针形，充满黄色内含物（图1-E）；乳汁管淡黄色（图1-F），菌盖表皮由杂乱菌丝组成，菌丝无色，顶端淡黄色，稍膨大，直径4.0～7.0 µm（图1-G）；菌柄表皮由排列整齐的菌丝和囊状细胞组成，菌丝直径5.0～9.6 µm，囊泡状细胞大小（18.0～33.6） µm×（12.0～32.0） µm，无色。

2.1.2 绒边乳菇（Lactarius pubescens Fr.） 子实体中等大，菌盖直径4.4～7.5 cm，起初半球形，后中部下凹呈漏斗状，边缘内卷且有絮状长绒毛，表面米白色或污白色，中间色深呈浅橙色至肉桂色，中间具稀疏的黄色绒毛（图2-A～B）；菌肉白色，厚，伤不变色；菌褶污白色，密，不等长，有从盖缘发出的短菌褶，乳汁白色，不变色；菌柄大小（2.7～4.0） cm×（1.5～2.0） cm，松软，圆柱形，污白色，有时具粉色色调。

担孢子大小为（6.0～8.1） µm×（4.4～6.5） µm，淡黄色，宽椭圆形表面具小疣（图2-C）； 担子大小为（28.8～43.4） µm×（7.2～9.6） µm，短棒状，无色（图2-D）； 褶侧囊体大小为（31.2～60.0） µm×（7.2～9.6） µm，披尖形，少，无色，有内含物（图2-E）。菌褶有胶状菌丝，直径4.3～5.8 µm，菌盖表皮由菌丝和囊状细胞组成，菌丝直径3.2～6.5 µm，囊状细胞大小为（19.6～35.0） µm×（12.0～20.0） µm（图2-F），菌柄表皮菌丝无色，顶端稍窄，直径9.6～16.8 µm。

2.1.3 灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr.] 子实体中等大，菌盖直径4.2～8.2 cm，扁半球形、中间下凹、边缘内卷、土黄褐色、黄棕色或棕褐色，表面光滑、湿时稍黏（图3-A～B）；菌褶离生，白色或米白色、干后色深呈棕色、乳汁白色；菌肉白色、干后米黄色、有辣味、无特殊气味；菌柄大小（2.5～6.0） cm×（0.6～1.4） cm，松软，圆柱形，污白色，伤变浅赭色。