番木瓜环斑病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

摘    要：番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是瓜类作物主要病毒之一，分析了甜瓜分离物HaNHK10的基因组序列和分子变异，构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示，HaNHK10分离物基因组全长为10 332 nt，与其他分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为74.60%～97.80%和85.30%～98.50%。基于全基因组序列的系统进化分析显示，HaNHK10与来自中国的所有分离物均聚集于II组中，并与中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD亲缘关系最近。接种试验显示，HaNHK10分离物的全长cDNA克隆具有侵染性，它能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和瓠瓜6种作物，经接种产生的病毒后代也能够通过摩擦接种侵染植株。

关键词：番木瓜环斑病毒；甜瓜分离物；基因组；侵染性克隆

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）02-008-07

The genome and infectious clone of papaya ringspot virus melon isolate

LIU Liming1， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1， LIU Xi1， GU Qinsheng1

（1. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan， China）

Abstract： Papaya ringspot virus （PRSV） is one of the most important viruses in cucurbits crops. In this study， the genome sequence of melon isolate HaNHK10 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA infectious clone was constructed. The results showed that the genome of isolate HaNHK10 was 10 332 nt in length， and the identities of the genome nucleotide sequence and amino acid sequence between HaNHK10 and other isolates were 74.60%-97.80% and 85.30%-98.50%， respectively. Phylogenetic analysis based on genome sequences showed that HaNHK10 and all the isolates from China were clustered in group Ⅱ， and zucchini isolate PRSV-SD from Shandong province was most closely related to HaNHK10. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon， cucumber， watermelon， pumpkin， zucchini and bottle gourd. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.

Key words： Papaya ringspot virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone

番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是一种单链正义RNA病毒，属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子呈弯曲线状，长度为700～900 nm，直径约为12.5 nm，在自然条件下，主要通过蚜虫以非持久性方式进行传播，也可通过农事操作进行传播。根据寄主范围不同，PRSV可分为番木瓜（papaya，P）株系和西瓜（watermelon，W）株系，其中，P株系侵染番木瓜和葫芦科作物，W株系侵染葫芦科作物，不能侵染番木瓜。PRSV侵染番木瓜后引起叶片花叶、畸形，茎秆和果实表面出现环斑，严重时叶片脱落、植株死亡；感染葫芦科作物后会引起叶片花叶、卷曲和畸形，植株矮化，果实畸形，严重影响作物的产量和果实的商品性。PRSV自20世纪40年代末在美国首次报道以来，目前在法国、巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、墨西哥、中国、澳大利亚、东帝汶、韩国、泰国、越南和印度等国均有发生[1-9]。在我国，自1964年PRSV在华南地区开始流行成灾后[10]，目前已在海南、台湾、广东、广西、福建、山东、河南、云南、四川等地发生[11-16]，给番木瓜和葫芦科作物的生产造成严重损失。

目前，国内外已报道了许多不同地理来源的PRSV分离物，并获得了许多分离物的全基因组序列信息[1，5，7，9，17-21]，通过分析发现PRSV不同分离株与其地理来源有显著的相关性[13，15，20-22]，但与其株系划分并不显著相关。通过分析NCBI数据库公布的PRSV全基因组序列信息，发现澳大利亚、巴西和东帝汶等国报道的均为W株系，分离物数量分别为13、3、4个，墨西哥和孟加拉国报道的均有2个分离物，且均为P株系，而我国报道的21个分离物中仅有4个为W株系，若要进一步分析不同株系间的进化关系，仍需更多的全基因组序列数据支撑[21]。对于我国报道的4个W株系，从寄主来源上来看，它们分别分离自南瓜、西葫芦和丝瓜，目前尚无甜瓜分离物及其全基因组序列信息。为了深入研究病毒与寄主之间的相互关系，获得病毒侵染性克隆至关重要。在PRSV侵染性克隆构建方面，目前已有成功构建PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分离物以及PRSV-W株系SD和CI分离物的侵染性克隆的报道[23-27]。从寄主来源看，PRSV-P株系均分离自番木瓜，PRSV-W株系SD分离物分离自西葫芦，W-CI分离自丝瓜，目前尚无PRSV-W甜瓜分离物侵染性克隆构建的相关报道。

笔者在2017年的葫芦科作物病毒病调查时从海南省海口市采集到一株PRSV-W甜瓜分离物，将其命名为HaNHK10[28]。以此为基础，笔者通过RT-PCR扩增获得该分离物的全基因组序列，并对其进行序列比对和系统进化分析，同时利用同源重组策略构建该分离物的全长cDNA克隆，通过接种试验分析其在不同瓜类作物上的侵染性，为在瓜类作物上开展该病毒的进化机制和分子致病性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021年4—9月在中国农业科学院郑州果树研究所进行，PRSV-W分离物HaNHK10采集于海南省海口市露地甜瓜发病植株。植物表达载体pXT1由南京农业大学陶小荣教授馈赠。

1.2 载体构建

取约0.1 g甜瓜发病叶片进行总RNA的提取和cDNA的合成，具体操作参照RNAsimple总RNA提取试剂盒和PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书。从GenBank数据库中下载PRSV的全基因组序列，通过比对分析序列的保守性，设计3对引物P-1F/P-1R、P-2F/P-2R、P-3F/ P-3R（表1），以合成的cDNA为模板，将分离物HaNHK10的全基因组分成3段进行扩增，利用NEBuilder高保真DNA组装预混液将获得的3个PCR产物与经Stu I和Sma I双酶切处理的植物表达载体pXT1进行同源重组、转化、筛选和测序验证，获得含有HaNHK10全基因组的cDNA克隆pPRSV-HaNHK10。

1.3 序列分析

对pPRSV-HaNHK10进行测序分析和拼接，获得HaNHK10分离物的全基因组序列。从GenBank数据库中下载76条来自不同国家的PRSV分离物的全基因组序列，利用ClustalW软件将它们与HaNHK10分离物进行序列比对，用BioEdit软件进行全基因组核苷酸和氨基酸序列一致性分析[29]。以西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）为外组，基于PRSV不同分离物的全基因组核苷酸序列，利用Mega X软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）进行系统进化分析[30]，重复1000次。

1.4 接种试验和病毒检测

接种试验于2021年6—8月在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组温室进行。其中，甜瓜品种为白玫，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供；黄瓜品种为津研4号，购自天津科润农业科技股份有限公司；西瓜品种为红和平，购自浙江浙农种业有限公司；南瓜品种为早栗蜜本，购自河北茂华种业有限公司；西葫芦品种为欧诺，购自太谷县雨润谷禾种业有限公司；瓠瓜品种为甬砧1号，由宁波农业科学院提供；当植株培养至子叶完全展开时开始试验。将pPRSV-HaNHK10转入农杆菌菌株GV3101中，然后利用农杆菌介导的方式接种甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和瓠瓜植株，以接种诱导缓冲液为阴性对照（CK），具体方法参照刘莉铭等[31]的报道。待甜瓜发病后，采集发病叶片用1×PBS缓冲液按照叶片与缓冲液1∶10的质量/体积比进行研磨，通过摩擦方式接种甜瓜和西瓜健康植株。将接种后的植株置于25～28 ℃条件下进行培养，观察植株发病情况。在每次试验中每种作物分别接种6株，并设置3次重复。待发病后，采集接种植株的系统发病叶片，提取叶片总RNA，利用HiScript® II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus）以P-5480F/ P-6980R为引物（目的片段长度约为1500 bp）对病毒的侵染情况进行检测，同时以P-9673F/P-T7-10045R为引物，对HaNHK10基因组9 673～10 045 nt区域进行扩增，PCR产物经体外转录获得地高辛标记的RNA探针，以利用dot blot方法进一步检测植株叶片中PRSV的侵染情况。

2 结果与分析

2.1 PRSV分离物HaNHK10基因组结构分析

PRSV分离物HaNHK10基因组全长为10 332 nt，GenBank登录号为OK465456，包含5′UTR（1～85 nt）和3′UTR（10 127～10 332 nt），编码1个由3346个氨基酸组成的多聚蛋白（86～10 126 nt），经蛋白酶切割形成11个成熟的蛋白质，包括P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP以及P3编码区内部通过+2移码产生的PIPO，具体的基因组结构如图1所示。

2.2 PRSV分离物HaNHK10序列分析

序列一致性分析结果显示，分离物HaNHK10与其他PRSV分离物之间的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为74.60%～97.80%、85.30%～98.50%。在这些分离物中，HaNHK10与中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD（MF085000）一致性最高，核苷酸和氨基酸序列一致性分别达到97.80%、98.50%，与孟加拉国的番木瓜分离物（MH444652）一致性最低，核苷酸和氨基酸序列一致性分别仅为74.60%、85.30%。

基于PRSV全基因组核苷酸序列的系统进化分析结果显示（图2），供试的77个PRSV分离物可以分为2组，其中，来自巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、法国和墨西哥的所有分离物均聚集于Ⅰ组，来自中国、东帝汶、韩国、泰国和越南的所有分离物均聚集于Ⅱ组，来自澳大利亚的13个分离物中有12个聚集于Ⅰ组，来自印度的13个分离物中有12个聚集于Ⅰ组，说明PRSV分离物与其地理来源有显著的相关性。另外，在Ⅰ组和Ⅱ组中，分离自番木瓜的分离物分别聚集在一起，分离自葫芦科作物的分离物分别聚集在一起，说明PRSV分离物与其寄主来源也有显著的相关性。其中，笔者获得的分离物HaNHK10与来自中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD（MF085000）亲缘关系最近，它们均聚于Ⅱ组中。