外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响

摘    要：为探究谷胱甘肽对硫代葡萄糖苷（GSLs）生物合成的影响，以现蕾期青花菜品种耐寒优秀为试验材料，研究不同浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及丁硫堇（BSO）对青花菜花球中硫代葡萄糖苷及其相关底物含量、酶活性和基因表达的影响。结果表明，与CK（蒸馏水）相比，5 mg·L-1 GSH在处理48 h显著提高了青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量，在24～48 h显著提高半胱氨酸（Cys）含量，在6～24 h显著提高了谷胱甘肽含量，在3～12 h显著提高了硫苷合成相关基因的表达量；45 mg·L-1 GSH处理在48 h显著降低了青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量，在3～48 h则显著提高了半胱氨酸含量，在6～48 h则显著提高了谷胱甘肽含量，在3～12 h显著抑制了硫苷合成相关基因的表达。与CK相比，5 mg·L-1 GSSG处理下青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量显著升高，而25、45及65 mg·L-1 GSSG处理则对总硫苷、脂肪族硫苷含量没有产生显著影响。综上所述，外源谷胱甘肽对硫苷含量的影响具有浓度效应，5 mg·L-1 GSH促进硫苷合成，45 mg·L-1 GSH抑制硫苷合成。

关键词：青花菜；硫代葡萄糖苷；谷胱甘肽（GSH）；酶活性；基因表达

中图分类号：S635.9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）02-052-09

Effect of exogenous glutathione on the synthesis of glucosinolates in broccoli

CHEN Fangzhen， ZHANG Wenxia， TANG Chenchen， LI Weihuan， WU Zhijian， WANG Junwei， WU Qiuyun， HUANG Ke

（Hunan Provincial Key Laboratory of Vegetable Biology/Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Innovation and New Variety Selection and Breeding， Ministry of Education/Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Horticultural Crop Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： To investigate the effects of glutathione （GSH） on glucosinolate （GSLs） biosynthesis， the effects of different concentrations of reduced glutathione （GSH）， oxidized glutathione （glutathione disulfide; GSSG）， and glutathione inhibitor （BSO） were studied on the content of glucosinolate and related substrates， enzyme activity， and gene expression in broccoli floret， using the broccoli variety Naihanyouxiu at the budding stage as experimental material. The results showed that， compared to CK， the 5 mg·L-1 GSH treatment significantly increased the total GSL and aliphatic GSL content in broccoli floret at 48 h. It significantly increased cysteine （Cys） content at 24-48 h， significantly increased glutathione content at 6-24 h， and significantly increased the expression of genes related to GSLs biosynthesis at 3-12 h. The 45 mg·L-1 GSH treatment significantly reduced the total GSL and aliphatic GSL content in the broccoli floret at 48 h， while significantly increasing cysteine content at 3-48 h and glutathione content at 6-48 h， and significantly inhibiting the expression of genes related to GSLs biosynthesis at 3-12 h. When compared with CK， the treatment with 5 mg·L-1 GSSG resulted in a significant increase in the content of total GSL， aliphatic GSL in broccoli floret， while treatments with 25， 45， and 65 mg·L-1 GSSG had no effect on the content of total GSL， aliphatic GSL. In conclusion， exogenous glutathione has a concentration effect on the GSLs content， with low concentrations promoting GSLs biosynthesis while high concentrations inhibiting GSLs biosynthesis.

Key words： Broccoli; Glucosinolate; Glutathione（GSH）; Enzyme activity; Gene expression

青花菜（Brassica oleracea L. var. italica Plenck．）为十字花科芸薹属甘蓝种蔬菜，含有丰富的膳食纤维、矿物质和植物活性物质硫代葡萄糖苷[1]，且具有预防癌症的效果，经常食用青花菜可以降低患有多种慢性疾病的风险[2-4]，因此市场需求逐年增加，在蔬菜周年供应中占有越来越重要的地位。

硫代葡萄糖苷（简称硫苷，glucosinolates，GSLs），是一类富含氮、硫元素的次生代谢产物，主要存在于十字花科植物中[5]。到目前为止，已鉴定的硫苷种类约130种[6]，硫苷生物合成前体物质来源于丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，根据前体氨基酸的不同可分为脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷[7-8]。植物中硫苷生物合成包括3个关键步骤：前体氨基酸的侧链延伸、核心结构的构建以及侧链的二次修饰[9-10]。其核心结构的形成和代谢途径的主要基因都已被鉴定[10-11]。简而言之，前体氨基酸被CYP79家族的细胞色素P450转化为醛肟，其中CYP79B2催化色氨酸吲哚-3-乙醛肟，CYP79F1转化所有长链型甲硫氨酸衍生物[12-13]。接下来，醛肟被CYP83家族的细胞色素P450氧化为活性化合物（氧化腈或酸式硝基化合物），活化的醛肟在多功能酶GSTs的作用下与硫供体（Cys或GSH）结合生成s-烷基硫代氢肟酸盐，其中GSTF11和GSTU20催化脂肪硫苷合成，GSTF9和GSTF10催化吲哚硫苷合成[14-15]，当以GSH为硫供体时，硝基化合物与GSH的共轭物还要在γ-谷酰基水解酶（GGP1）的水解作用下才能进入下一步反应。s-烷基硫代氢肟酸盐通过C-S裂解酶SUR1转化为硫代氢肟酸[16]，其在UGT74家族的葡萄糖基转移酶和硫转移酶的作用下形成脱硫葡萄糖苷，其中UGT74B1被证明能代谢苯丙氨酸的衍生物，UGT74C1在脂肪硫苷生物合成中起作用[17-18]。脱硫硫苷在磺基转移酶ST的作用下硫酸化形成完整的硫苷核心结构。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽[19]，以GSH（还原型）和GSSG（氧化型）存在植物体内，其中以GSH为主，且只有GSH具有生理活性[20]。GSH被称为“主要抗氧化剂”，可直接或者间接参与植物活性氧（ROS）清除[21]。影响谷胱甘肽合成的因素有很多，但最重要的是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）活性和半胱氨酸（Cys）浓度，γ-ECS是GSH合成的限速酶（由GSH1编码），其活性受到细胞内GSH浓度的反馈抑制，当GSH浓度过高时，GSH与γ-ECS的调节位点结合，使活性中心变构失活，从而抑制GSH的合成。谷胱甘肽与GSLs合成的关系主要有2个方面：一方面是，谷胱甘肽可作为GSLs合成的还原性硫供体；另一方面是，谷胱甘肽通过调节初级硫代谢间接影响GSLs的合成[22-23]。已有研究发现，外源GSH处理优先激活抗性系统提高植物抗氧化能力，抑制GSLs合成[24]。然而，外源谷胱甘肽对硫苷合成调控机制的研究报道较少。因此，笔者研究的目的是通过测定硫代葡萄糖苷的组分和含量、硫苷合成过程中关键基因的表达量、GSH的含量和GSH1、GSH2的表达，初步分析GSH影响青花菜硫苷合成的主要途径。

1 材料与方法

1.1 材料

供试青花菜品种为耐寒优秀，种子购自高华种子有限公司。试验于2022年12月至2023年2月在湖南农业大学蔬菜科研基地进行。选取饱满一致的种子播种于装有育苗基质的50穴育苗盘中育苗。待幼苗生长至4片真叶时，将植株定植在装有育苗基质的栽培袋中置于塑料大棚内。青花菜植株现蕾后，挑选长势一致无病虫害的植株，进行外源谷胱甘肽处理。

本试验设置了GSH、GSSG、BSO（索莱宝生物科技有限公司）3个处理，GSH和GSSG设置4个处理：5、25、45、65 mg·L-1，BSO设置1个处理：25 mg·L-1，以蒸馏水作为对照，试验采取随机区组设计。将大棚划分为10个小区，将各处理随机排列，每小区种植18株，6株为1次重复，每个处理共3次重复。处理期间于08：00开始喷施，以花球均匀布满液滴为准（每小区各喷施1200 mL），每隔3 d处理1次。共喷施7次，最后1次处理时，选取无病虫害的花球分时间点于0、3、6、12、24 h取样进行基因表达和生理分析，于48 h取样进行硫代葡萄糖苷含量分析及其他生理分析。取样时，用小刀从花茎基部将花球割下，再用剪刀将花蕾剪下并用锡箔纸包好后迅速放入液氮冷冻，保存-80 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 硫代葡萄糖苷含量测定 硫代葡萄糖苷含量检测参照已报道的方法[25-26]，并略做修改。称取0.1 g冷冻干燥样品，加入4 mL 70%甲醇和100 µL Sinigrin（5 mmol·L-1，内标）提取20 min，提取后，加入醋酸钡，8000 r·min-1离心10 min。收集上清液，沉淀中加入70%甲醇重新提取，混合提取的上清液。将提取液加入DEAE Sephadex A 25层析柱，液体流尽后加入硫酸酯酶，室温反应16 h后洗脱获得脱硫硫苷溶液。使用高效液相色谱法检测硫苷含量（b）并计算（以µmol·g-1表示）。

硫苷含量/（µmol·g-1）=。

1.2.2 半胱氨酸（Cys）含量和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）活性测定 采用索莱宝生物科技有限公司的试剂盒对半胱氨酸（Cys，BC0185）含量、γ-ECS（BC1215）活性进行测量。

1.2.3 谷胱甘肽含量测定 采用索莱宝生物科技有限公司的试剂盒对谷胱甘肽（GSH，BC1175）含量进行测定[27-28]。