贝莱斯芽孢杆菌SM2对番茄灰霉病的生防效果

摘 要：为探寻高效防治番茄灰霉病（Botrytis cinerea）的优良菌株及其防治机制，从番茄根分离获得内生菌SM2，经平板对峙法分析其对B. cinerea的抑菌特性，并通过生理生化特征和16S rDNA测序对其进行鉴定；采用盆栽法和田间试验测定SM2对番茄灰霉病的防效，并测定防病组、致病组和对照组番茄叶片的生理生化指标等。结果表明，菌株SM2可引起B. cinerea菌丝发生畸变，抑菌率达66.67%，被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）；SM2有效降低了番茄灰霉病的发病率和病情指数，盆栽、田间防效分别达到71.73%、65.22%。与对照组相比，防病组和致病组番茄叶片的SOD活性、APX活性、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均显著升高，且防病组显著高于致病组。来自番茄的贝莱斯芽孢杆菌SM2是一株具有生防应用价值的菌株，通过显微拮抗作用和诱导番茄高表达保护酶活性与渗透调节物含量等途径有效防治番茄灰霉病。

关键词：番茄；灰霉病；贝莱斯芽孢杆菌；拮抗作用；诱导系统抗性；生物防治

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）02-066-08

Biological control effects of Bacillus velezensis SM2 against Botrytis cinerea causing tomato gray mold

ZHANG Qi1， LIU Yingmin2， YANG Dongyan2， ZHU Xiaoqin2， PEI Dongli2， ZHANG Qingchen2

（1. College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China; 2. Henan Provincial Engineering Research Center for Development and Appllication of Characteristic Microorganism Resources/College of Biology and Food， Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000， Henan， China）

Abstract： The aim was to find an excellent strain for efficient biological control and biocontrol mechanism of tomato gray mold （Botrytis cinerea）. Endophytic bacteria SM2 of tomato root was isolated and purified by plat marking. The inhibitory effect of the strain SM2 on mycelial growth of B. cinerea was studied in dual cultures on PDA plates. Furthermore， the strain SM2 was identified according to physiology and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing. The biocontrol effect of the strain SM2 against B. cinerea was determined by pot and field experiments， and the physio-biochemical characteristics of tomato leaves in biocontrol group， disease group and control were analyzed. The results showed that strain SM2 was identified as Bacillus velezensis， which could cause mycelium distortion of B. cinerea， with inhibition rate of 66.67%. Pot and field investigation showed that B. velezensis SM2 effectively reduced the incidence and disease index of B. cinerea， and the biocontrol efficiency reached 71.73% and 65.22%， respectively. Compared with the control， SOD activity， APX activity， proline content and soluble protein content of tomato leaves in the biocontrol group and disease group were significantly increased， and the increase rate of biocontrol group was significantly higher than that of disease group. The above results demonstrate that B. velezensis SM2 is a valuable biocontrol strain， which can effectively suppress tomato gray mold through micro-antagonism and induce the increase of antioxidant enzymes activity and osmoregulation substances content of tomato.

Key words： Tomato; Botrytis cinerea; Bacillus velezensis; Antagonism; Induce systemic resistance; Biological control

番茄（Solanum lycopersicum L.）富含维生素C和番茄红素等多种营养物质，是栽培广泛、消费量大的蔬菜作物之一[1]。然而，在番茄的生长期和贮运过程中常发生番茄灰霉病，该病菌主要危害其叶片、果实等，严重威胁番茄的产量和品质，目前已成为番茄生产上最重要的病害之一[2-3]。番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一种世界性真菌病害[4]，目前农业生产上因缺乏抗灰霉病番茄品种，防治方法主要为化学农药防治[5]。化学杀菌剂效果虽好，但容易导致环境污染、病原物耐药性增强、农药残留和生态破坏等问题[6]。生物防治具有安全、无残留、环保等优点，可以有效解决化学药剂产生的上述问题，因此已成为蔬菜绿色生产的研究热点。其中，芽孢杆菌（Bacillus）因具有抗逆性强、抑菌谱广、杀菌高效等优点，已被广泛用于番茄真菌病害的生物防治[7]。在盆栽试验中，高地芽孢杆菌（B. altitudinis）B1-15在6叶期接种的番茄灰霉病防效显著[7]；枯草芽孢杆菌（B. subtilis）L1-21对采后番茄果实灰霉病防效显著[1]；短小芽孢杆菌（B. pumilus）PTB180和PTB185利用其产生的脂肽类物质、抗菌活性可显著抑制番茄灰霉病[8]；摩加夫芽孢杆菌（B. mojavensis）D50发酵液处理番茄后，诱导了番茄果实的抗氧化酶活性和系统抗性相关基因（SlLoxD、SlMyc2等）高表达，灰霉病的发病率下降33.50%[9]；贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）HY19发酵液可显著提高盆栽番茄叶片抗氧化酶活性，降低番茄灰霉病发病率，防效为73.12%～76.51%[10]；B. velezensis X7对盆栽番茄黄萎病的防效为67.16%[11]；B. velezensis SH-1471发酵液对盆栽番茄枯萎病的防效为93.80%[12]；蜡样芽孢杆菌（B. cereus）EC9通过茉莉酸/乙烯激活免疫保护番茄抗枯萎病[13]。上述研究表明，多种芽孢杆菌均能起到防治番茄真菌病害的效果，但生物防效有所不同，且研究多为盆栽生物防效。鉴于此，探索分离更多高效的芽孢杆菌，并利用其综合开展盆栽和田间防效及其生防机制的研究是非常必要的。笔者从番茄根内分离并鉴定内生菌SM2，分析其发酵液对番茄灰霉病的盆栽和田间的防治效果，并从显微拮抗作用和诱导番茄系统抗性两个方面探讨生防机制，旨在为微生物菌剂的研发提供生防菌种和对番茄灰霉病生防应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试生防菌株SM2于2022年5月采自商丘师范学院番茄示范园区，从水塘边野生健壮的番茄根内分离获得并鉴定；供试番茄灰霉病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）；供试番茄为Moneymaker，于2023年5月在商丘师范学院测定盆栽和田间病圃番茄的生防等相关指标参数。灰霉病菌B. cinerea和番茄Moneymaker均由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄内生细菌SM2的分离、纯化与筛选 参照张庆琛等[11]的方法，对水塘边野生健壮的番茄进行采样、消毒，取根并加入无菌水研磨至匀浆；将匀浆液稀释、涂布于溶菌肉汤（LB）固体培养基上，37 ℃恒温培养箱培养24 h；将单菌落划线纯化后，采用平板对峙培养法筛选对番茄灰霉病菌B. cinerea具有拮抗的内生细菌SM2，并按照下列公式计算抑菌率，9次重复。

1.2.2 番茄内生细菌SM2的鉴定 生理生化鉴定：参照赵诗佳等[14]的方法分析SM2菌株的革兰氏染色、淀粉水解、甲基红、过氧化氢酶、吲哚乙酸、明胶液化试验；参照东秀珠等[15]的方法测定SM2菌株的乙酰甲基甲醇试验（V-P test）、柠檬酸盐利用、乳糖、蔗糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、甘油、产铁载体等试验，并观察菌株形态特征。

SM2菌株分子生物学鉴定：提取SM2基因组DNA，利用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）/1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）、796-F（5'-GHCGBGGKATYCCDGTY-3'）/796-R（5'-TTYGTYTTBGTYTGNCC-3'）[16]分别对16S rDNA、gyrB基因进行PCR扩增。PCR反应体系均为50 μL：模板DNA 60 ng、上下游引物（10 μmol·μL-1）各1 μL、Buffer （Mg2+） 0.5 μL、dNTP 5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O补至50 μL。16S rDNA 基因PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸8 min。gyrB基因PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用GenBank数据库进行比对并下载与SM2菌株序列高度同源的16S rDNA和gyrB序列，采用MEGA5.0进行比对，去除两端不整齐的序列，使用PhyloSuite软件[17]中的Concatenate Sequence工具拼接有效区间，再次导入MEGA5.0，基于Maximum Likelihood （ML）算法构建16S rDNA和gyrB联合系统进化树，以Amphibacillus marinus J1作为外类群。