代谢组和转录组联合解析青花菜芽苗黄酮类物质对外源ABA的响应机制

摘    要：为探究植物激素脱落酸对青花菜芽苗黄酮类物质合成的作用机制，以青花菜品种耐寒优秀为试材，以清水为对照，外源喷施50 μmol·L-1的ABA，对处理后的青花菜芽苗进行代谢组和转录组的联合分析。结果表明，代谢组共检测出14类物质，包含黄酮共212种，具有明显差异的黄酮共30种。其中，儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和桑色素含量明显上升，柚皮苷、银锻苷和枸橘苷含量明显下降。通过代谢组和转录组联合分析，黄酮合成途径、苯丙烷合成途径以及ABA信号通路共筛选出13个相关调控基因，其中LOC106337270、LOC106329559、LOC106326133对儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和桑色素含量呈明显正相关，推测上述基因可响应ABA信号参与调控黄酮类化合物的生物合成。综上所述，研究结果表征了青花菜芽苗响应外源ABA并调控黄酮类化合物合成的关键基因，为后续黄酮类化合物的生物合成调控奠定了科学理论基础。

关键词：青花菜；黄酮；转录组；代谢组；外源ABA

中图分类号：S635.9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）03-035-10

The metabolome and transcriptome jointly resolve the response mechanism of flavonoids in broccoli sprouts to exogenous ABA

TANG Chenchen， ZHANG Wenxia， CHEN Fangzhen， WU Zhijian， HUANG Ke， WANG Junwei

（Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Genetic Resources of Horticultural Crops （Vegetables， tea， etc.）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Whampoa Innovation Research Institute， Hunan Agricultural University/Engineering Research Center of Horticultural Crop Germplasm Innovation and New Variety Breeding， Ministry of Education/Hunan Provincial Key Laboratory of Vegetable Biology/College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： In order to investigate the mechanism of action of the phytohormone abscisic acid on the synthesis of flavonoids in broccoli sprouts， the cauliflower Naihan Youxiu was used as the test material. The metabolome and transcriptome were jointly analyzed in treated broccoli sprouts with exogenous spraying of 50 μmol·L-1 ABA while using water as control. The results showed that a total of 14 categories of substances were detected in the metabolome， including 212 flavonoids. Among them， there were 30 kinds of flavonoids with significant differences. The content of catechin gallate， epicatechin gallate and morin hydrate increased significantly， while those of naringin， argyragin and lycioside decreased significantly. A total of 13 regulatory genes related to flavonoid synthesis pathway， phenylpropane synthesis pathway and ABA signaling pathway were screened by combining metabolome and transcriptome analysis. Among them， LOC106337270， LOC106329559 and LOC106326133 showed significant positive correlation with the content of catechin gallate， epicatechin gallate and morin hydrate. Therefore， we speculated that these genes could be involved in regulating the biosynthesis of flavonoids in response to ABA signals. In summary， this study characterized the key genes of broccoli sprouts in response to exogenous ABA and regulation of flavonoid synthesis， which lay a scientific theoretical foundation for the subsequent regulation of flavonoid biosynthesis.

Key words： Broccoli; Flavonoids; Transcriptome; Metabolome; Exogenous ABA

青花菜（Brassica oleracea L. var. italica）是十字花科芸薹属一二年生蔬菜作物，起源于欧洲，又名意大利芥蓝、西蓝花等，因其营养丰富且富含多种生物活性物质，被称为“蔬菜皇冠”[1-2]。青花菜可食用部位以花球为主，但随着研究的深入，发现青花菜芽苗内的生物活性物质含量远高于成熟植株，且青花菜芽苗具有生长周期短、病虫害少等优点[3-4]，近年来逐渐成为研究热点。植物生物活性物质多为次生代谢产物，具有抵御生物或非生物逆境以及作为信号分子等作用。植物的次生代谢响应环境变化，在植物的生长、发育等方面发挥重要作用。研究显示，青花菜的次生代谢物质主要包括硫代葡萄糖苷、多酚、黄酮等[5-6]。

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的多酚次级代谢产物，可分为二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄酮醇、黄烷酮等，在植物抵御逆境胁迫中起重要作用，对人体具有抗氧化活性、抗炎症等作用[7]。黄酮类化合物的合成会受多种因素影响，包括生物和非生物因素，如激素等[8]。有研究表明，脱落酸（ABA）会促进拟南芥中查尔酮合成酶（CHS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）的表达，从而诱导黄酮醇的积累[9]。相似的研究结果在番茄中也有报道，通过对番茄进行外源ABA处理后，番茄果实内总黄酮含量逐渐升高[10]。类黄酮类化合物以苯丙烷为合成前体，其合成过程受一系列酶基因和调控基因的影响，其中调控基因可以直接或间接调控类黄酮生物合成相关结构基因的表达水平，进而影响黄酮类化合物的生物合成[11]。目前已报道的黄酮类化合物合成途径的关键酶主要有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄酮合酶（FNS）、黄酮醇合成酶（FLS）、无色花色素还原酶（LAR）等[12]。有研究显示，外源ABA会影响PAL、C4H、FLS、CHS等基因表达进而影响黄酮类化合物的生物合成[13]，但是目前关于ABA调控黄酮合成的具体机制尚未明确。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，组学技术作为一种检测方式日趋成熟。其中，代谢组学是最接近植物表型的组学，可直接用于对植物产生的代谢物进行定性定量分析。转录组学是基因表达和调控检测的有力手段，可对机体生理变化过程进行转录层面的剖析[14-16]。转录组和代谢组的关联分析可将基因和表型建立联系，通过差异基因和差异代谢物的分析，从“因”和“果”两方面明确植物的代谢途径，进一步揭示植物的代谢调控网络[17]。有研究报道，通过转录组和代谢组的联合分析发现，外源亚精胺[18]、茉莉酸甲酯[19]、蓝光[20]等均可调控黄酮类化合物的合成。笔者的研究通过转录组和代谢组联合分析，建立植物表型和基因型之间的联系，明确外源ABA处理后青花菜芽苗中黄酮类物质的代谢差异和基因表达差异，并进一步挖掘青花菜芽苗响应外源ABA并调控黄酮类化合物合成的关键基因，为后续黄酮类化合物生物合成调控提供基因资源和技术手段。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为青花菜品种耐寒优秀，具有耐寒、长势旺等优良特性，种子购于广东金作农业科技有限公司。脱落酸（ABA）购买于索莱宝公司，型号为A8060。

1.2 方法

试验于2022年11月在湖南农业大学人工气候室进行。将珍珠岩装于育苗托盘内（长、宽、高分别为32.5、24.5、4.5 cm），深度约为2.5 cm。选取颗粒饱满的耐寒优秀种子，室温浸种6 h后置于纱布上并放入25 ℃的人工光照培养箱内进行黑暗催芽处理，待其露白后均匀点播于珍珠岩上，每盘300粒，并覆盖一层珍珠岩，随后置于人工气候室内进行培养。人工气候室环境条件设置为温度22 ℃、相对湿度70%～80%。待种子发芽露根在85%以上，随即置于光照下进行培养，光照条件为光强20 000 lx，光周期12 h/12 h（昼/夜）。采用随机区组设计，每个处理3次重复（共3个托盘）。外源ABA处理浓度选择以前期的试验结果为依据，采用50 μmol·L-1 ABA处理青花菜芽苗。光照下缓苗1 d后进行处理，每次09：00进行外源ABA喷施（50 μmol·L-1），以清水为对照，每盘喷施20 mL，连续喷施7 d，并于第7天15：00进行随机取样，分别用于检测转录组和代谢组，取样后立即放于液氮中速冻，存贮于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 广泛靶向代谢组测定 样品提取：将样品置于冻干机中真空冷冻干燥后使用研磨仪研磨（30 Hz，15 min）至粉末状，称取50 mg样品粉末置于2 mL离心管中，并加入1200 μL内标提取液后立即涡旋，每30 min涡旋1次，每次30 s，共涡旋6次。随后1200 r·min-1离心3 min，取上清液，经微孔滤膜（0.22 μm）过滤后保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS检测。液相色谱条件主要包括，色谱柱：AgilentSB-C18 1.8 µm，2.1 mm×100 mm；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度：0 min B相比例为5%，9 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10～11.1 min B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量4 μL。质谱条件主要包括：电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体Ⅰ（GSⅠ），气体Ⅱ（GSⅡ）和气帘气（CUR）分别设置为50、60和25 psi，碰撞诱导参数设置为高。通过去簇电压（Declustering potential，DP）和碰撞能（Collision energy，CE）的优化，对每个时期的洗脱代谢物进行检测。代谢物定性定量分析：通过数据库MWDB（Metware database），根据二级谱信息进行物质定性分析。通过3重4级杆对碎片离子进行过滤和筛选，排除干扰离子后进行质谱分析，对所有物质色谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。