葫芦科作物离体雌核发育技术研究进展

摘    要：单倍体或双单倍体对作物改良、遗传育种具有重要意义，对提高单倍体的诱导频率、建立高效稳定的离体雌核诱导体系至关重要。而常规育种周期长、工作量大，且遗传性状存在不稳定性。在葫芦科作物中通常通过未授粉子房、胚珠离体培养的途径产生单倍体或双单倍体植株，从而获得纯合的自交系，使基因快速纯合，极大地缩短育种年限。对葫芦科作物离体雌核发育技术进行了综述，影响离体雌核发育结果的主要因素有供体植株的基因型、培养基及添加的外源激素、黑暗热激与预冷处理方式、播种季节、子房发育时期等。同时也概括了再生植株的倍性与加倍方法，为后续葫芦科作物离体雌核发育的研究提供参考依据。

关键词：葫芦科作物；离体雌核发育；离体培养；影响因子

中图分类号：S642+S65             文献标志码：A            文章编号：1673-2871（2024）04-001-06

Research progress on in vitro gynogenesis technology of Cucurbitaceae crops

ZHANG Chengtao， SONG Huijuan， SUN Xiangyu， DAI Sihui， SUN Xiaowu

（College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： Haploid or double haploid plays an important role in crop improvement and genetic breeding. It is very important for increasing the induction frequency of haploid and establishing an efficient and stable in vitro gynogenetic induction system. The conventional breeding cycle is long， the workload is heavy， and the genetic characters are unstable. Haploid or double haploid plants are usually produced by in vitro culture of unpollinated ovary and ovule， so as to obtain homozygous inbred lines， which can make genes homozygous quickly and shorten breeding life greatly. In this paper， the authors reviewed the techniques of in vitro gynogenesis of cucurbit crops， and found that the main factors affecting the results， including the genotypes of the donor plants， the medium and added exogenous hormones， the methods of dark heat shock and pre-cooling， the sowing season， and the stage of ovary development. Besides， the methods of ploidy and doubling of regenerated plants were also summarized， to provide reference for the subsequent research on the development of in vitro female nuclei of cucurbitaceae crops.

Key words： Cucurbit crops; In vitro gynogenesis; In vitro culture; Influencing factors

收稿日期：2023-11-06；修回日期：2024-01-27

基金项目：湖南省科技厅重点研发项目（2022NK2007）

作者简介：张成桃，女，在读硕士研究生，研究方向为南瓜分子育种。E-mail：2855184023@qq.com

通信作者：孙小武，男，教授，主要研究方向为瓜类育种。E-mai：sun0070@139.com

戴思慧，女，教授，主要研究方向为瓜果蔬菜学。E-mail：daisihui@126.com

常规的育种手段周期长、变异小，需要一种能快速、准确繁育出携带所需性状的纯合植株的方法。利用离体雌核培养诱导技术可以快速得到纯合植株，缩短育种周期，加快育种进程。但在葫芦科离体雌核发育的过程中受到许多因素的影响，导致类胚诱导率、出胚率较低等许多问题。因此，通过改进试验技术、方法来提高其诱导效率，建立稳定性好、重复性高的未授粉子房离体培养技术，在葫芦科作物育种中具有重要意义。笔者对影响葫芦科离体雌核发育技术的几个因素进行了综述，为今后离体雌核发育技术研究提供一些参考依据。

1 影响因素

1.1 基因型

大量研究表明，供体材料的基因型是决定离体雌核发育成功的首要因素，不同基因型的雌核在离体培养过程中再生能力存在着明显差异。在南瓜中发现，不同基因型供体材料在相同诱导条件下，胚状体的诱导率差异显著[1-2]。陈玲[3]也有相似的发现，供试的7份材料中有一品种胚珠难以膨大转绿。在黄瓜的研究中也表明，胚状体的发生因基因型而异[4]，曹冰东等[5]选用的9个不同基因型的黄瓜在同一条件下进行离体培养，出胚率存在显著差异，最高的为95.93%，最低的为8.15%。在西瓜中，李迎迎[6]发现，同一诱导培养基上，不同基因型材料的胚珠膨大率有很大的差别，且不同基因型材料胚状体诱导率之间也存在着差异。荣文娟[7]的研究也表明，基因型对未受精胚珠离体培养的诱导有重要影响。在西葫芦中也有研究表明，同一诱导条件下，不同基因型之间的出胚率有明显差异[8-10]。说明在葫芦科作物中，供体材料的基因型是影响离体雌核发育的关键因素，而基因型是不可改变的因素，某些基因型在未授粉子房离体培养过程中难以建立稳定性强和重复性好的体系，因此在未授粉胚珠子房离体培养中基因型的选择至关紧要。

1.2 培养基与生长调节剂

在葫芦科作物离体雌核培养研究中，大多选用固体培养基，且以MS作为基础培养基，通常添加蔗糖和葡萄糖[11-13]。翟庆慧[14]发现，无论是未受精子房，还是未受精胚珠都是在以蔗糖为碳源时的诱导率更高，通常应用3%的蔗糖作为基本碳源[15-17]。而武习习[18]在2018年首次对南瓜未受精胚珠采用培养液振荡法培养，并且胚珠愈伤组织基本全部转绿。这说明培养液可能更加适合诱导未受精胚珠。

荣文娟等[19]发现，西瓜未受精胚珠与未受精胚珠诱导出的愈伤组织接种在不加任何外源激素的MS基本培养基上，全部褐化死亡，冯诚诚等[12]在苦瓜上也有类似发现。周霞等[11]也发现，黄瓜未受精子房切片在未添加激素的MS培养基上无明显变化。在西葫芦上，未添加激素也不能诱导出再生植株[8]。何娅[20]在南瓜中也有相同发现。前人的研究表明，不添加任何激素的MS培养基对胚珠的诱导作用很小，在培养过程中是需要一定种类及浓度的激素诱导的。在葫芦科离体雌核发育过程中应用较多的激素有以下几种。

2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）是诱导多种植物离体细胞转变为胚性细胞的重要激素。在南瓜中，不少研究表明培养基中未添加一定浓度的2，4-D时，难以诱导胚状体的形成，添加一定浓度的2，4-D就可以诱导出胚状体[21-22]。而且2，4-D以较高质量浓度4 mg·L-1与其他生长调节剂组合使用时胚状体诱导率较高[1，23]。说明2，4-D对南瓜离体雌核发育是重要的。但李玲等[24]在西瓜中发现，在只添加2，4-D的培养基上，愈伤组织不分化，不能获得芽点。

TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑脲）是离体雌核发育过程中常用的生长调节剂。高宁宁等[25]研究发现，TDZ能够促进胚状体的形成，在0.03 mg·L-1时对甜瓜的诱导频率最高。冯诚诚等[12]在苦瓜上也发现，在诱导培养基中添加TDZ有利于胚状体的发育分化。而柯思佳[26]发现，在甜瓜中，试验所选的3个不同基因型的材料以MS为基本培养基，不添加TDZ的雌核发育反应率分别为0、4%、8%，而添加0.02与0.04 mg·L-1的TDZ其雌核发育反应率为70%～98%，且0.04 mg·L-1的效果好于0.02 mg·L-1。李建欣等[27]在黄瓜中有类似的发现，在只含有一种激素TDZ的培养基中胚状体很难分化为幼苗，应转接到一定浓度6-BA和NAA的培养基中。唐桃霞等[28]在西葫芦中也发现TDZ与NAA组合使用时比单独使用时诱导效果更好，其中以0.05 mg·L-1 TDZ＋0.25 mg·L-1 NAA时效果最好。

AgNO3起到抑制乙烯活性的作用，培养基中加入适量的AgNO3，能起到促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用。其对黄瓜未授粉子房培养中的胚状体发生率起到积极作用[15，17，29]，在南瓜中，孙守如等[21]发现，没有添加AgNO3的培养基的出胚率最高，显著高于添加AgNO3的处理，随着培养基中AgNO3浓度的增加，未受精胚珠的出胚数大幅下降，说明其对南瓜子房离体培养起到抑制作用[21]。唐桃霞等[28]发现，在西葫芦未授粉子房离体培养过程中，AgNO3对胚状体诱导不明显，却可以显著减少玻璃化胚的发生，但质量浓度过高会影响胚状体的发生。出现不同现象的原因可能是供体的种类与基因型不同，对AgNO3的敏感程度不一样。

NAA、IAA、6-BA等也广泛应用于葫芦科作物离体雌核培养过程中，所使用的浓度、种类组合在不同的材料中有所不同[3，8，13-14，22，30]。唐桃霞等[31]发现，甜瓜胚珠膨大率与内源激素IAA含量呈极显著正相关，说明IAA是参与植物生长发育的重要激素。程慧等[32]发现，在西葫芦未受精子房的离体培养中，不添加6-BA、NAA或只添加其中任一种激素的处理均不能诱导出胚状体，在2种激素共同存在时均能诱导出胚状体。培养基中不同植物生长调节剂的种类和浓度配比对离体雌核发育的诱导有着极其重要的影响，适宜质量浓度的激素组合会比单独一种激素的效果更佳。但是不同作物甚至不同品种所适用的植物生长调节剂的种类、浓度及组合有所不同，这需要在今后的研究中不断地完善和更新。

1.3 不同预处理

对未受精子房接种之后进行预处理，不同的处理方法对未受精子房胚珠的诱导效果大不相同。有研究表明，在其他条件相同时，35° C黑暗热激处理5 d的南瓜和西葫芦未授粉子房胚珠的反应效果较好，胚珠膨大率和转绿率较高[33-35]。李禹琪[36]和胡芳芳[37]分别发现，南瓜在38 ℃条件下热激5 d、西葫芦35 ℃黑暗热激6 d时效果最佳。李建欣等[27]在黄瓜中发现，对3个不同基因型的黄瓜35 ℃热激处理3 d时，胚状体诱导率均达到最高值，而处理4 d的诱导率开始下降，5 d的为最低。郭晓雨等[38]研究发现，35 ℃热激4 d时，黄瓜雌核启动率最高。还有研究发现，黄瓜子房在4 ℃下处理4 d时，植株再生率最高[39]。荣文娟等[19]发现，西瓜以35 °C黑暗热激3 d为宜，但也有研究发现，35 ℃热激处理4 d的子房雌核启动率和芽点率是最高的[24]。闵子杨等[40]研究发现，在35 ℃黑暗条件下热激5 d时，西瓜胚珠出胚率较高。甜瓜在35 ℃热激处理3 d时效果最好[25]，也有研究发现，热激处理4 d时反应最好[26]，以上研究结果都证明，对西瓜、甜瓜胚珠离体培养较好的热激温度为35 ℃。牛明明[41]研究发现，在甜瓜中30 ℃暗培养3 d时为最佳热激处理。苦瓜未授粉子房热激33 ℃处理3 d的诱导效果最好，有利于苦瓜胚状体膨大和胚珠转绿[12]。瓜类作物的最佳热激处理的温度和时间各不相同，可能是由于所选用的供体材料品种不同。Malik等[16]对温度预处理和不同浓度TDZ之间的相互作用进行研究，发现0.04和0.02 mg·L-1的TDZ，都是4 ℃预冷处理比没有温度预处理的诱导胚状体效果较好。