糙皮侧耳原基发育关联物质及代谢通路分析

摘    要：为揭示糙皮侧耳原基发育的潜在调控物质，采用代谢组学的方法对糙皮侧耳菌丝体和原基细胞代谢物进行检测分析。结果表明，菌丝体与原基细胞的代谢物具有显著差异。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）≥1和倍数变化≥ 2或≤ 0.5为条件共筛选到400种差异代谢物。调控通路分析表明，这些差异物质涉及33条代谢通路，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨酰tRNA生物合成、嘌呤代谢等8条代谢通路具有极显著影响。谷氨酸和谷氨酰胺涉及p < 0.01的大部分代谢通路，可能在糙皮侧耳原基发育过程中具有重要调控作用。研究结果为糙皮侧耳以及其他大型真菌原基发育机制的探索提供了理论依据。

关键词：糙皮侧耳；原基发育；代谢组学；差异代谢物；代谢通路

中图分类号： S646.1+41 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-052-09

Analysis of associated substances and metabolic pathways involved in primordium development of Pleurotus ostreatus

LIU Qin1， KONG Weili1， CUI Xiao1， NIU Senyuan2， SHI Ziwen3， WU Jie3， LIANG Xuedi3， LIU Yang2

（1. Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Edible Fungi Germplasm Resources in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to reveal the potential regulatory substances involved in primordium development of Pleurotus ostreatus， the metabolomics was used to detected the cellular metabolites in mycelium and primordium. The results showed that there were significant differences between the cellular metabolites in mycelium and primordium. A total of 400 differential metabolites were screened under the condition of VIP（varible importance in the projection）≥1 and fold change≥2 or ≤0.5 using orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. According to pathway analysis， these differential substances might involve 33 metabolic pathways， among which 8 metabolic pathways， including alanine， aspartate and glutamate， aminoacyl tRNA biosynthesis and purine metabolism， had extremely significant effects. Glutamate and glutamine involved in most of the metabolic pathways with p< 0.01， therefore they might play an important regulatory role in primordium development of P. ostreatus. This study provides a theoretical basis for exploring the development mechanism of P. ostreatus and other macrofungus.

Key words： Pleurotus ostreatus; Primordium development; Metabolomics; Differential metabolite; Metabolic pathways

大型真菌因其独特的香气、风味、质地和药用特性而广受消费者喜爱[1]。目前，世界上可食用的大型真菌有近2000种，因为称之为食用菌，其中有不少于35种已经实现在全球范围内大规模种植[2]。糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是世界上最广泛种植和消费的食用菌之一，具有栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[3]。糙皮侧耳可将农业废弃物转化为高营养价值的食品，能有效提高种植者的收益[4]。此外，糙皮侧耳含有大量的多糖（β-葡聚糖）、膳食纤维、不饱和脂肪酸、多肽、糖蛋白和抗氧化化合物，也是钠、钾、钙、镁、磷等矿物质和维生素的重要来源[5]。研究表明，糙皮侧耳还具有显著的抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎及免疫调节等活性，深受消费者青睐[6-8]。

糙皮侧耳的生长发育一般分为两个阶段：第一阶段为营养生长阶段，从接种直至菌丝生理成熟；第二阶段为生殖生长阶段，即子实体发生和发育阶段，从原基形成到子实体成熟[9]。食用菌原基发生是子实体形成和产量效益的前提和基础，目前对食用菌的研究主要集中在营养生理、风味物质以及功能物质方面，对原基发生和发育的研究非常有限[9-11]。陈鹏至等[12]研究表明，富马酸、琥珀酸、6-磷酸葡萄糖酸、甜菜碱等13种仅在原基中检测到的小分子物质可能对亚洲兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）原基的发育具有至关重要的作用。杨晓敏等[13]采用核磁共振、气相质谱和液相质谱3种检测技术对亚洲兰茂牛肝菌的菌丝体及原基的小分子物质进行比较分析，推测谷氨酸在原基发育中起着重要的调控作用。李玉等[14]研究表明，茉莉酸甲酯可促进金针菇原基的形成。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新学科[15]，旨在检测特定条件下有机体或细胞内内源性代谢物的整体轨迹，以反映生物体的病理或生理过程，而检测到的一些差异代谢物已成为表征生物体病理或生理状态的潜在标记物[16]。代谢组学已广泛应用于疾病诊断、药物开发、微生物代谢、动植物代谢等多个领域[17-19]。近年来，代谢组学技术逐渐应用于食用菌领域，研究食用菌在特定环境条件下的代谢机制。Zhao等[20]基于GC–MS非靶向和靶向代谢组分析鉴定了高温胁迫下香菇菌丝代谢组的变化。Du等[17]采用代谢组学技术分析了白灵菇菌丝生理成熟期第0天、第35天（17 ℃）和第35天（29 ℃）菌丝细胞外代谢物的差异，确定了CA-asp可作为菌丝生理成熟的标志物。Qiu等[21]利用GC-MS和LC-MS分析了高温条件下P. ostreatus菌丝体胞外代谢物的变化，并研究了外源添加一些显著增加的代谢物对曲霉和木霉生长的影响，以确定P. ostreatus容易被Trichoderma asperellum感染的原因。这些研究为利用代谢组学方法探索糙皮侧耳原基发育过程中的代谢谱提供了指导。笔者研究团队前期较为系统全面地阐明了糙皮侧耳原基和子实体之间以及子实体发育过程中菌丝体中代谢物的差异[22-23]，但关于糙皮侧耳菌丝如何扭结形成原基的机制尚不明确。因此，笔者采用代谢组学的方法比较糙皮侧耳原基发育期菌丝体和原基中代谢产物的差异，并分析相关调控通路，旨在解析糙皮侧耳原基发育的重要调控物质，从而为改进糙皮侧耳栽培方法以及最大限度地提高产量和质量提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

豫黑平16（CNA20191002079）保存于河南省食用菌种质资源库。

1.2 方法

栽培试验于2022年2－5月在河南省农业科学院现代农业试验示范基地进行。糙皮侧耳栽培采用18 cm × 36 cm × 0.05 cm聚丙烯袋，配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰1%。接种后第35天，收集同一栽培袋的菌丝体（M组）和刚形成的原基（P组）。样品收集和检测参考刘芹等[22]的方法。

1.3 数据分析

采用Analyst 1.6.1软件（AB SCIEX，Ontario， Canada）进行代谢物数据分析。2组样本间代谢物的差异分析采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和多变量监督方法偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。VIP（varible importance in the projection）≥ 1、倍数变化≥2或≤0.5的代谢物作为差异代谢物进行组间区分[24]。差异代谢物的代谢通路分析在MetaboAnalyst 5.0平台（https：//www. metaboanalyst. ca）上进行。采用R语言绘制热图和气泡图，采用Gephi软件绘制代谢通路富集关系图。

2 结果与分析

2.1 化合物鉴定结果

基于UPLC-MS/MS检测平台和自建数据库共检测到534个代谢物，其中脂质126个、氨基酸及其衍生物100个、生物碱54个、核苷酸及其衍生物57个、有机酸79个、酚酸类44个、木质素和香豆素3个、鞣质2个及其他类69个（图1）。

2.2 质控分析

如图2所示，菌丝体样品（M组）和原基样品（P组）的组内相关性均非常接近1，说明组内样品相关性强，组内生物学重复性好。同时组内样品相对组间样品的相关系数高，说明获得的差异代谢物非常可靠。

2.3 主成分分析

通过对M组和P组进行主成分分析（PCA），发现前3个主成分共解释了95.07%的原始变量（PC1：85.98%，PC2：5.88%，PC3：3.21%），基本反映了所有变量的信息（图3-a）。PCA结果显示组间分离趋势较好，表明M组和P组样本间的代谢组存在显著差异。由图3-b可知，M组和P组分别位于PC1的正负方向，样品组呈现出明显的组别聚类趋势。因而，PCA能够从整体上说明M组和P组之间的代谢产物具有明显的差异。

正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结果表明，M组和P组样品点分布在不同的区域，实现了这两组样品间的完全分离（图4-a），说明两组代谢产物种类和（或）含量上存在明显差异。OPLS-DA得到主成分1的方差贡献率为87.00%、主成分2的方差贡献率为5.43%。模型质量参数R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力。一般认为，R2X，R2Y和Q2越接近于1，则模型越稳定可靠，Q2＞0.5时则认为是有效的模型，Q2＞0.9为出色的模型。由图4-b可知，对OPLS-DA进行置换验证试验（n = 200），X轴方向模型的累积解释率R2X=0.924，Y轴方向模型的累积解释率R2Y=1、模型的累积预测率Q2=0.999。因此，可认为建立的OPLS‐DA模型稳健可靠，可用来探索M组和P组的代谢物差异。