苦瓜枯萎病抗性生理研究及鉴定评价体系构建

摘    要：通过苦瓜枯萎病抗性生理研究，构建高效精准的苦瓜枯萎病抗性鉴定评价体系，旨在为苦瓜抗枯萎病种质资源筛选及抗病品种选育提供理论基础。以热科2号苦瓜为试验材料，选用灌根法、胚根法和伤根法在苦瓜2叶1心期接种不同浓度的苦瓜枯萎病菌，分析不同接种时间的病情指数和生理响应的差异情况，以及不同接种方法和接种浓度对病害的影响。结果表明，采用灌根法接种1×106 个·mL-1的枯萎病菌，在第25天时病情指数为37.1，显著低于1×107 个·mL-1、显著高于1×104 个·mL-1，苯丙氨酸解氨酶活性和叶绿素含量显著低于胚根法，多酚氧化酶活性与可溶性蛋白含量与胚根法相比无显著差异。在苦瓜幼苗2叶1心时采用灌根法接种1×106 个·mL-1的枯萎病菌，25 d时鉴定发病情况，可作为精准高效鉴定苦瓜枯萎病抗性的体系。

关键词：苦瓜；枯萎病；病情指数；抗性生理；鉴定评价技术

中图分类号：S642.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-069-10

Resistance physiological study and evaluation system establishment on Fusarium wilt of bitter gourd

LING Yi1， 2， YANG Yan2， NIU Yu2， YU Renbo2， LIU Zhaohua2， LIU Pingwu1， HAN Xu2

（1. College of Tropical Agroforestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， Hainan， China）

Abstract： Through the study of bitter gourd Fusarium wilt resistance physiology， the authors have constructed an efficient and precise identification and evaluation system for bitter gourd Fusarium wilt resistance， aiming to provide a theoretical basis for the screening and evaluation of Fusarium-resistant germplasm resources and the selection and breeding of disease-resistant varieties. In this study， Reke No. 2 bitter gourd was used as the test material， and selected the root irrigation， radicle root and injure root methods to inoculate different concentrations of Fusarium wilt fungus liquid at the time of two-leaf and one heart of bitter gourd， and investigated the effects of different inoculation methods and inoculation concentrations on the Fusarium wilt by analyzing the differences in disease index and physiological responses at different inoculation times. The results showed that the disease index was 37.1 using the root irrigation inoculated fungus with 1×106·mL-1 at 25 d， which was significantly lower than that of 1×107·mL-1， and significantly higher than that of 1×104 ·mL-1. PAL activity and chlorophyll content were significantly lower than the radicle method， and no significant difference existed between PPO activity and soluble protein content. When bitter gourd seedlings of two-leaf and one heart were inoculated with 1×106·mL-1 fungus using the root irrigation method， the disease incidence was identified at 25 d， which can serve as an accurate and efficient identification system of bitter gourd Fusarium wilt resistance.

Key words： Bitter gourd; Fusarium wilt; Disease index; Resistance physiology; Identification and evaluation technology

苦瓜（Momordica charantia L.）属葫芦科苦瓜属植物，是重要的食药同源蔬菜作物，亦是海南省冬种北运的主要蔬菜作物，占据着冬季蔬菜市场的重要份额[1]。苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一种严重影响苦瓜产量和品质的土传病害，在任何生育期均能侵染并造成危害，严重时可引起整株萎蔫死亡[2]。随着复种指数的逐年增加，苦瓜枯萎病日益加剧，严重制约着苦瓜产业的健康发展[3]。苦瓜枯萎病菌在土壤中的存活力和致病力较强，难防难治，选育抗病品种是最经济有效的方法，而高效精准的鉴定评价技术体系是抗病品种选育的重要基础。近年来有关瓜类作物枯萎病抗性鉴定评价的研究多集中在黄瓜和西瓜上，关于苦瓜枯萎病抗性鉴定技术的研究鲜有报道[4]，目前仍未形成精准完善的高效鉴定评价技术体系。尖孢镰刀菌常用的接种方法有灌根法、胚根法、伤根法、蘸根法、浸根法等[5]。左存武等[6]用浸根法和灌根法将Foc TR4接种不同抗性的香蕉品种，比较分析接种后香蕉的发病情况，结果表明，灌根法的接种效果最好，接种后各品种发病情况与品种本身的实际抗性最为接近。种质来源、环境条件、接种方法、接种浓度、鉴定时间等均能影响苦瓜枯萎病的抗性鉴定，因此，制定简单、高效、统一的鉴定评价技术方案是解决这一问题的重要手段。笔者以中抗枯萎病品种热科2号苦瓜为试验材料，采用不同接种方法、不同菌液浓度、不同鉴定时间等方法研究苦瓜枯萎病的抗性生理机制，综合分析病情指数、根系形态及各项生理指标等，构建高效精准的鉴定评价技术体系，为提高苦瓜种质枯萎病鉴定评价效率和精准度及抗病品种选育提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

苦瓜品种热科2号是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所自主选育的中抗枯萎病品种。

供试病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4501（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae），由广西农业科学院蔬菜研究所陈振东研究员提供。

1.2 方法

试验于2023年6－7月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所植物培养室及抗逆生理与分子生物学实验室完成。

1.2.1 浸种催芽 供试苦瓜种子浸泡于55 ℃温水中8 h，用湿润的4层纱布包裹种子，放置在28 ℃培养箱中培养2～3 d，种子露白待用。

1.2.2 枯萎病菌菌液的制备 试验以清水为对照（CK），以不同孢子浓度（1×104、1×105、1×106、1×107个·mL-1）的尖孢镰刀菌4501为处理。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上接种尖孢镰刀菌4501，置于28 ℃培养箱中培养7 d，使用打孔器取直径7 mm的尖孢镰刀菌菌饼接种至马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）中，在温度为28 ℃、120 r·min-1的条件下振荡培养7 d，然后用双层纱布过滤菌丝，留母液待用。

1.2.3 接种方法 为提高鉴定评价的精准度，所有试验均在人工培养室中进行，室内温度保持在（28±1） ℃，湿度80%，光照度2500 lx。分别对灌根法、胚根法和伤根法3种接种方法的病情指数和抗病等级进行鉴定，筛选适宜的接种方法。

灌根法：将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵（7 cm×7 cm）中，置于塑料托盘内（每个托盘放21个营养钵），每隔2 d在托盘中加入500 mL水以保证基质湿润。待苦瓜幼苗生长至2叶1心时采用灌根法接种枯萎病菌[7]，在距根际1 cm处用注射器注入20 mL菌液，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

胚根法：种子露白后待胚根长至1 cm时采用胚根法接种枯萎病菌[8]，将种子浸泡在菌液中1 h，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，后将种子播于装满无菌基质的营养钵中，并置于塑料托盘内，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

伤根法：将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵中，并置于塑料托盘内，当幼苗长至2叶1心时采用伤根法接种枯萎病菌[9]，将幼苗根部基质洗净，剪掉根的三分之一，在孢子悬浮液中浸泡30 min，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，后将幼苗重新移栽至无菌基质中，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

1.2.4 测定指标与方法 选择2种适宜的接种方法，分别于接种后0、5、10、15、20和25 d采集根系和同一叶位（第1、2片真叶）的叶片样品，每个处理随机取9株，设3次重复，根系样品拍照用以分析根系形态，叶片用锡纸包裹迅速转移至液氮中速冻，取样完成后将叶片样品储存于-80 ℃超低温冰箱中，待测各项生理指标。采用胚根法接种菌液的植株在0 d时还处于种子阶段，因此在0 d时无法进行叶片取样。

取0.2 g苦瓜叶片样品放置于已预冷的研钵中，随后加入1 mL pH=7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下将其研磨成匀浆，然后使用磷酸缓冲液冲洗研钵及研磨棒，将其倒入匀浆中，使总体积为10 mL。将样品在4 ℃条件下进行10 000 r·min-1的离心操作，离心20 min后得到上清液，上清液作为苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）以及可溶性蛋白质的提取液。参照邹芳斌等[10]的方法测定PAL活性，参照郑莲姬等[11]的方法测定PPO活性，参照王凤婷等[12]的方法测定叶绿素含量，参照青格尔等[13]的方法测定可溶性蛋白含量。

采用万深LA-S系列植物图像根系分析系统对根系形态进行分析。