甜瓜抗枯萎病资源筛选及抗病生理指标相关性分析

摘    要：为明确黑龙江地区甜瓜枯萎病生理小种，探究枯萎病胁迫下甜瓜生理指标变化，完善甜瓜枯萎病抗病评价体系，利用表型鉴定结合分子标记辅助选择（MAS，marker-assisted selection）对24份甜瓜资源进行抗病筛选。结果表明，黑龙江省尖孢镰刀菌甜瓜专化型Fm-1为1号生理小种。分子标记辅助选择共筛选出抗病资源15份，感病资源9份，具有较高的筛选效率。其中野生型资源1314抗性最强，发病率仅为10%；栽培种22-152的感病程度最高。利用筛选的两个抗性极端材料在幼苗期接种病原菌并于根部取样，测定抗病生理指标并进行相关性分析。结果表明，枯萎病胁迫下的抗病和感病材料生理指标响应差异显著，过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性与发病率呈极显著负相关；丙二醛含量和相对电导率与发病率呈极显著正相关。综上，利用功能性分子标记可在早期实现精准筛选甜瓜抗枯萎病品种，相对电导率和CAT及PAL活性可作为抗枯萎病评价的首选指标。

关键词：甜瓜；枯萎病；抗病资源筛选；生理指标测定；相关性分析

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）07-059-08

Screening of melon resources resistant to Fusarium wilt and correlation analysis of physiological indexes of disease resistance

LIU Tai， WANG Di， XU Huichun， DU Zhiqiang， HU Xixi， ZHANG Ling， CHE Ye， QI Wenju

（Daqing Branch， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Daqing 163711， Heilongjiang， China）

Abstract： In order to identify the physiological race of melon Fusarium wilt in Heilongjiang province， and improve the evaluation system of melon Fusarium wilt disease resistance， 24 melon varieties were screened for disease resistance using phenotype identification combined with marker-assisted selection（MAS）. The results showed that the specific type Fm-1 of Fusarium oxysporum from Heilongjiang province was physiological race No. 1. A total of 15 resistant resources and 9 susceptible resources were screened by marker-assisted selection with high screening efficiency. The wild-type resource 1314 had the most resistant， the incidence of which was only 10%. The cultivated-type 22-152 had the highest degree of infection. Two resources with extreme resistance were inoculated with pathogens at seedling stage and sampled at root. The physiological indexes of resistance were determined and the correlation analysis was carried out. The results showed that the physiological indexes of resistant and susceptible materials were significantly different under wilt stress， and the activities of catalase（CAT）， phenylalanine aminolyase（PAL）， superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）were significantly negatively correlated with incidence rate. Malondialdehyde content and relative conductivity were significantly positively correlated with incidence rate. In conclusion， functional molecular markers can be used to accurately screen melon varieties resistance to Fusarium wilt at an early stage， and relative conductivity and CAT and PAL activities can be used as the preferred indicators for evaluation of Fusarium wilt resistance.

Key words：Melon; Fusarium wilt; Screening of resistant resources; Physiological index determination; Correlation analysis

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物，具有极高的营养价值和经济价值[1]。随着设施园艺栽培技术的推广，由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）引起的枯萎病愈发严重，制约着世界范围内甜瓜生产和优质新品种选育[2]。枯萎病在甜瓜全生育期均可发生且传播速度极快，具有极强的传染性和较高的致死率，对甜瓜产量和品质造成严重影响[3-4]。相关研究表明，植物的抗病性与组织结构和防御酶活性等因素有着十分密切的关系[5]，特别是超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶活性对病害响应差异较大[6]。枯萎病菌侵染后，各级抗性植株体内的抗氧化酶活性会出现不同程度的提高以快速清除由病害胁迫所产生的过量超氧自由基[7-11]。植株在枯萎病胁迫下所产生的超氧自由基诱导脂质中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用是造成细胞损伤的主要原因，而丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化的主要产物之一，直接反映了细胞的脂质过氧化水平和生物膜损伤程度。同时，损伤的膜结构通透性增大，电解质外渗，从而导致细胞浸提液的相对电导率（REC）增高。因此，MDA含量和REC可作为衡量植物抗病性的重要指标[12-13]。

甜瓜具有丰富的基因型和复杂的抗病遗传机制。自1976年Risser等[14]首次发布甜瓜抗尖孢镰刀菌基因Fom-1和Fom-2后，截至目前共发现了5个抗枯萎病基因[15-17]。其中，研究较为深入的基因有Fom-1、Fom-2和Fom-3，目前已成功将Fom-1和Fom-2基因进行了克隆[18-19]。不同甜瓜品种中所含有的抗病基因不同，对尖孢镰刀菌各生理小种的抗性也有所差异。目前已经鉴定出4个生理小种，分别为小种0、1、2和1.2[16，18-20]。品种Doublon和Hemed含有抗病基因Fom-1，抗甜瓜枯萎病专化型生理小种0和2，感生理小种1和1.2；品种CM17187和Makdimon-1含有抗病基因Fom-2，抗生理小种0和1，感生理小种2和1.2；品种MR-1、Top Mark和Perlita FR含有抗病基因Fom-3，抗生理小种0、1和2，感生理小种1.2[14，16，21-22]。以遗传物质中核苷酸差异为基础的DNA标记是不同生物品种在分子水平上的直接反映。自20世纪RFLP标记技术用于检测品种间遗传变异多态性以来，SSR、CAPS、As-pcr等各种标记方式都逐步应用到了甜瓜的抗病分子育种实践中。凌悦铭等[23]利用高抗和高感霜霉病甜瓜品种为亲本构建F2代分离群体，基于BSA-seq结果开发了许多Indel标记，可用于区分抗病品种。王士伟[24]基于抗病和感病甜瓜材料Fom-2基因的LRR区单碱基差异，开发出功能性分子标记，可较为精准地筛选抗病品种。

针对当前黑龙江地区甜瓜枯萎病生理小种的研究较少，且基于甜瓜遗传背景的复杂性和基因型的多样性，进一步完善甜瓜抗枯萎病鉴定评价体系对抗枯萎病甜瓜资源的筛选及选育抗病品种具有重要意义。笔者利用国际通用鉴别寄主在甜瓜幼苗期接种枯萎病菌，鉴定黑龙江地区枯萎病生理小种，利用表型鉴定结合分子标记辅助选择技术对24份甜瓜资源的抗病性进行鉴定，同时利用筛选的高抗和高感品种对抗病生理生化指标进行测定和相关性分析，探索CAT、PAL、SOD和POD活性以及MDA含量和REC与甜瓜抗病性的关系，进一步完善甜瓜抗枯萎病评价体系，以期为丰富甜瓜抗病种质资源库和甜瓜抗枯萎病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的24份甜瓜资源包含厚皮甜瓜西州密25号、金香翠蜜、22-178、22-173、22-128、22-138、22-155、22-165、22-176、22-172，薄皮甜瓜甘一美香、争春二号、泽甜豹纹、泽甜早香蜜、泽甜翠苹果、22-166、22-152、22-175、22-120、22-122、22-140、22-114、22-106和1份野生型资源1314。其中，西州密25号由河北粒尔田种业有限公司提供，金香翠蜜由大庆萨中种业提供，甘一美香、争春二号、泽甜豹纹、泽甜早香蜜、泽甜翠苹果由齐齐哈尔泽甜种业有限公司提供，其他资源为黑龙江省农业科学院大庆分院自主选育的高世代自交系。甜瓜幼苗皆种植于黑龙江省农业科学院安达育种基地，设置随机区组试验。每份资源设3次生物学重复，各重复选取长势一致的植株20株。待植株成长至两片真叶期进行接菌观察。

1.2 试验方法

1.2.1    枯萎病病原菌生理小种鉴定    参试病原菌菌株为2023年6月在黑龙江省农业科学院安达育种基地甜瓜病根分离获得的尖孢镰刀菌（F. oxysporum）Fm-1，全试验过程均在HDL超净工作台中进行。为了保证病原菌的致病性并确定参试菌株的生理小种，笔者以4个国际通用生理小种鉴别寄主为试材，分别为 Charentais T、Doublon、CM17-187 和 MR-1，由黑龙江省农业科学院园艺分院提供。不同鉴别寄主对生理小种的抗感性反应见表1[25]。

1.2.2    甜瓜抗枯萎病筛选试验    2023年6月，挑选各品种饱满种子25粒于安达育种基地内进行催芽育苗。2023年7月将分离获得的尖孢镰刀菌菌株在PDA培养基上活化复苏，菌种复苏后用无菌水将菌液稀释至 1×106个·mL-1，用于接种。2023年7月中旬，待植株长至两叶一心时挑选长势一致的植株，使用蘸根法接菌。植株接种后置于接种室，室内昼夜（16 h/8 h）交替，温度为26 ℃/20 ℃。在接菌10 d后统计发病情况，参考刘朋义等[5]的方法对植株进行病情分级，统计病情指数和品种抗性。病情指数计算公式如下：