芦笋SSR-PCR反应体系的优化及验证

摘    要：以芦笋幼叶为材料，采用单因素与L16（43）正交试验相结合的方法，对影响芦笋SSR-PCR反应的3个因素（2×Taq Master Mix，模板DNA，引物）进行优化，并以此为基础通过退火温度和循环次数试验筛选引物最佳退火温度和循环次数。结果表明，芦笋基因组DNA的SSR-PCR最优反应体系为：10 µL反应体系中，50 ng·µL-1 DNA模板0.125 µL，10 µmol·L-1 上下游引物各0.5 µL，2×Taq PCR Mix 3 µL，灭菌ddH2O 5.875 µL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循环25次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。经5对引物组合和5个不同芦笋品种DNA扩增验证，该体系稳定可靠，可用于芦笋遗传多样性分析、种子纯度鉴定、分子标记辅助育种及重要农艺性状的图位克隆等工作。

关键词：芦笋；SSR-PCR反应体系；正交设计

中图分类号：S644.6 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）07-100-07

Optimization and validation of SSR-PCR reaction system for Asparagus officinalis L.

BAI Yang， YI Zehui

（College of Horticulture， Shanxi Agricultual University， Taiyuan 030031， Shanxi， China）

Abstract： Based on DNA of asparagus young leaves， a single factor screening test combined with a L16（43） orthogonal design method was employed to optimize the factors of 2×Taq Master Mix， template DNA， and primer combination applied for SSR-PCR and followed by gradient annealing temperature test and gradient cycle times test to screening the optimum annealing temperature and cycle numbers. The results showed that the optimal SSR-PCR system for asparagus included 50 ng·µL-1 DNA template 0.125 µL， 10 µmol·L-1 primers 0.5 µL， 2×Taq PCR Mix 3 µL， sterilized ddH2O 5.875 µL， with a total reaction volume of 10 μL. The PCR amplification procedure for asparagus was： 94 ℃ pre-denaturation for 4 min， 94 ℃ denaturation for 30 s， 60 ℃ annealing 30 s， 72 ℃ renaturation for 35 s， 25 cycles， 72 ℃ extension for 10 min， 4 ℃ for storage. This reaction system was proved to be stable and reliable by PCR amplification with 5 pairs of primer combinations and DNA templates of five different asparagus cultivars. The optimized SSR-PCR reaction system could be satisfactorily used for genetic diversity analysis， seed purity identification， marker-assisted breeding and map-based cloning of important agronomic traits of asparagus.

Key words： Asparagus officinalis; SSR-PCR reaction system; Orthogonal design

芦笋又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生草本植物，富含矿物质、多糖、皂苷、氨基酸、维生素和芦丁等多种营养成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多种药理功能，深受国内外关注，被誉为“蔬菜之王”[1-4]。目前，我国已成为世界第一大芦笋生产国和出口国，经济效益显著。然而，我国芦笋育种起步较晚，技术滞后，缺乏拥有自主知识产权的优良品种，生产上仍以国外品种为主，如阿波罗、格兰德、紫色激情等，已成为影响我国芦笋产业发展的主要因素之一[5]。

分子标记是对DNA进行检测，实现了对基因型的直接选择，具有多态性丰富、鉴定方法简捷、准确性高等优点，已广泛应用于作物的分子生物学和遗传育种研究[6-7]。简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）是由1～6个核苷酸组成的基序，经多次重复形成的DNA片段[8]。与RAPD、SRAP等分子标记相比，SSR标记具有分布广泛、多态性高、重复性好、共显性和操作简便等优点[9]，已广泛应用于遗传多样性分析[10]、分子标记辅助育种[11-12]及重要农艺性状定位[13-14]等领域。SSR标记属于PCR标记类型，检测结果易受Taq聚合酶、引物、模板、Mg2+和dNTPs等诸多因素影响。因此，开展芦笋SSR-PCR反应体系优化至关重要，可为SSR分子标记应用于芦笋种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种和重要农艺性状的图位克隆奠定基础，对加速芦笋新品种选育和优异基因挖掘具有重要意义。目前，前人已经对多个物种开展了SSR-PCR反应体系的优化研究，如木麻黄[15]、云南草果[16]、白及[17]、短丝木犀[18]等，发现不同物种的最优反应体系各异，具有一定的物种特异性。然而，SSR分子标记在芦笋中的应用研究进展缓慢，仅有部分基于EST序列和基因组序列的SSR标记开发的报道[1，19-20]，且彼此间反应体系存在较大差异，尚未见关于芦笋SSR反应体系优化的研究报道，尤其是现今广为应用的PCR Mix。

鉴于上述背景，笔者以PCR Mix为基础，采用正交设计对SSR-PCR反应体系中的PCR Mix、引物和模板进行优化，并以此为基础对扩增程序中的退火温度和循环次数进行进一步优化，以期获得适用于芦笋的稳定性高、重复性好的反应体系，为SSR标记应用于芦笋的遗传育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以冠军、TC、京绿芦1号、特立龙和新科2030共5个芦笋品种为试验材料，其中冠军和TC来自山东省潍坊市农业科学院，京绿芦1号来自北京市农林科学院蔬菜研究所，特利龙和新科2030来自美国沃克兄弟公司。试验于2020年6月30日开始，种子经3% NaClO溶液消毒后，采用40 ℃温水浸种48 h后催芽，待大部分种子露白时，采用32孔穴盘育苗，基质配比为V椰糠∶V草炭∶V蛭石∶V珍珠岩=2∶1∶1∶1。幼苗期每个品种随机选择5株采集健康、新鲜幼叶，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱备用。试验用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒和SanTaq Plus PCR Mix预混液均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 芦笋基因组提取与检测

参照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明提取芦笋DNA，经微量紫外分光光度计检测，其质量浓度范围为452.3～625.8 ng·µL-1，OD260/OD280比值在1.82～2.02；经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带清晰明亮、无弥散，可用于后续PCR扩增。采用ddH2O将DNA质量浓度稀释至50 ng·µL-1，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 SSR引物来源及筛选

以3个芦笋品种冠军、TC、京绿芦1号DNA为模板，随机挑选马振川[1]开发的芦笋EST-SSR引物5对（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。参照胡一凡等[16]PCR反应体系并略作修改，10 µL体系具体包括：50 ng·µL-1 DNA模板0.5 µL，10 µmol·L-1上下游引物各0.5 µL，2×Taq PCR Mix 4 µL，灭菌ddH2O 4.5 µL。PCR扩增程序参照马振川[1]的报道并略作修改，具体为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循环35次，72 ℃延伸10 min。扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 芦笋SSR-PCR反应体系优化

1.4.1 单因素试验 在初筛试验基础上，以条带明亮、杂带较少的冠军品种DNA为模板、LS6组合为引物，对影响PCR反应的3个主要因素（2×Taq PCR Mix、引物和模板）进行单因素优化，其中引物浓度10 μmol·L-1，DNA质量浓度50 ng·μL-1。以初筛试验的PCR体系为基础组成，设置8个梯度的单因素试验（表2），用ddH2O补齐10 µL，分别筛选2×Taq PCR Mix、引物和模板的最适用量。扩增程序同1.3，设3次重复。采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测扩增产物，分别用0.2% AgNO3和1.5% NaOH溶液进行染色和显色。

1.4.2 正交优化试验 经单因素试验，分别选取3个影响因素中扩增效果较好的4个水平，即2×Taq PCR Mix为1.000、2.000、3.000和4.000 µL；50 ng·µL-1 DNA模板为0.125、0.250、0.500和0.625 µL；10 µmol·L-1引物为0.125、0.250、0.375和0.500 µL。采用L16（43）设计3因素4水平正交试验（表3），筛选最优组合，每个组合3次重复。扩增产物检测方法同1.4.1。

1.5 芦笋SSR-PCR退火温度和循环次数的优化

以最优PCR体系为基础，优化LS6引物组合的PCR扩增程序，设置退火温度和循环次数的单因素试验，筛选最适退火温度和循环次数。设置54、56、58、60和62 ℃共5个退火温度，选取目标条带清晰、杂带较少的为最适退火温度。采用最适退火温度，设置20、25、30、35和40次循环，选择条带清晰、杂带较少的最少循环次数为最适循环次数。

1.6 芦笋SSR-PCR最佳反应体系的验证

基于优化后的SSR-PCR反应体系和扩增程序，用5对SSR引物组合对5个芦笋品种DNA模板进行扩增，以检测最佳反应体系的稳定性和通用性。

2 结果与分析

2.1 引物及模板初步筛选

由图1可知，引物组合LS23和LS20扩增条带亮度和清晰度较低，且存在部分模板未扩增出目标条带的现象；引物组合LS13和LS22扩增条带亮度和清晰度最高，但是均存在不同程度的杂带；引物组合LS6条带较为清晰，未发现明显杂带，且以冠军DNA为模板的条带亮度和清晰度明显优于京绿芦1号和特立龙。因此，选择冠军DNA和LS6引物组合进行后续PCR反应体系优化试验。

2.2 芦笋SSR-PCR反应体系的单因素试验

由图2可知，2×Taq PCR Mix、引物和模板用量均会对芦笋SSR-PCR扩增效果产生明显影响。在2×Taq PCR Mix单因素试验中，1～4水平初始用量的反应体系均可明显扩增出目标条带，其中，1/2倍用量条带清晰且杂带较3/4和1倍体系少。因此，10 µL PCR反应体系中2×Taq PCR Mix最佳用量为2 µL；引物单因素试验中，8个引物用量的体系均可扩增出目的条带，其中2～4水平用量体系的目标条带最为清晰。考虑引物用量的经济适用性，以0.25 µL为引物最佳用量；模板DNA单因素试验中，8个用量的反应体系均可清晰扩增出目标条带，1～3、5～6、8水平初始用量的反应体系条带清晰度基本一致，明显优于4和7水平用量，且1和2水平用量的杂带较少。基于经济节约原则，10 µL PCR反应体系中DNA最佳用量为0.125 µL。综上可知，10 µL PCR反应体系中2×Taq PCR Mix、10 µmol·L-1引物和50 ng·µL-1 模板的最适用量分别为2、0.25和0.125 µL。