干旱胁迫对丘北辣椒根际细菌群落结构的影响

摘    要：为探究干旱胁迫下丘北辣椒根系分泌物对根际微生物组的影响和塑造，通过盆栽控水方法，以正常种植为对照（CK），干旱种植为处理（DS），利用Illumina-MiSeq高通量测序技术分析不同处理下细菌群落的差异。结果表明，干旱胁迫导致辣椒叶绿素含量和根系活力显著降低，而可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性显著提高。干旱处理显著降低细菌群落多样性指数（Chao1、Shannon和Simpson），同时发现CK与干旱处理细菌群落结构相似度较小，具有显著差异。差异分析表明，干旱处理显著促进了放线菌门Actinobacteria、中生根瘤菌属Mesorhizobium等有益微生物的富集。研究结果为丘北辣椒在干旱环境下适应机制研究及石漠化地区辣椒高效栽培提供了新的见解和思路。

关键词：丘北辣椒；干旱胁迫；16s rRNA；根际细菌

中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-057-10

Impact of drought stress on the rhizosphere bacterial community structure of Capsicum annuum in Qiubei

WANG Can1，2， XU Junqiang1， MENG Fanlai3， ZHANG Yinghua1， WANG Shaoxiang2， ZHAO Qiangbiao2， XU Bin1

（1. College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， Yunnan， China; 2. Agricultural Science Academy of Wenshan Prefecture， Yunnan Province， Wenshan 663000， Yunnan， China; 3. School of Biological Sciences and Agriculture， Honghe University， Mengzi 661100， Yunnan， China）

Abstract： In order to investigate the effects of root exudates from Qiubei pepper under drought stress on rhizosphere microbial communities and their shaping， a pot experiment was conducted using controlled watering methods. Normal cultivation was used as the control（CK）， while drought cultivation served as the treatment（DS）. The differences in bacterial community were analyzed using Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology. The results revealed that drought stress significantly reduced chlorophyll content and root vitality of pepper. Conversely， soluble sugar， proline， malondialdehyde content， and superoxide dismutase activity exhibited significant increases. Drought treatment notably decreased bacterial community diversity indices （Chao1， Shannon， and Simpson）. Furthermore， it was observed that CK and drought treatments displayed limited similarity in bacterial community structure with notable differences. Differential analysis demonstrated that drought treatment effectively promoted enrichment of beneficial microorganisms such as Actinobacteria and Mesorhizobium genus in rhizosphere soil. These findings provide novel insights into the adaptation mechanisms of Qiubei pepper under drought conditions and offer efficient cultivation strategies for peppers in rocky desertification areas.

Key words： Qiubei pepper; Drought stress; 16s rRNA; Rhizosphere bacteria

干旱严重影响作物的生长和发育，导致作物产量和品质下降，是世界粮食安全和作物生产力的主要制约因素之一。云南省是我国辣椒种植区之一，主要分布在文山、红河等地。辣椒作为我国普遍栽培的蔬菜，是广大农民增收的经济作物之一，适应性强、产业链长、营养成分丰富、具有较大的商业开发潜力，栽培面积逐年扩大[1]。文山地处云南边境，特殊的地理气候环境造就了丰富多样的辣椒种质资源，如丘北辣椒、富宁小米椒等。但同时文山地处喀斯特岩溶山原地区，石漠化现象较为严重，导致土壤生产力下降、植被退化、水土流失等环境生态问题及当地贫困面扩大等社会问题[2]。丘北辣椒是茄科辣椒属一年或多年生草本植物，是云南省特有的地方品种，色泽红亮，味道香辣醇厚，具有独特的口感，深受广大农民和消费者的喜爱，其产品得到国内外市场认可[3-4]。在如此恶劣的环境中，丘北辣椒经过长期的自然选择和进化，具备了耐盐害、耐贫瘠、耐干旱、稳产等特点，形成了一系列形态、生理、生化和分子策略应对干旱等逆境胁迫。

大量研究表明，植物通过根系向根际土壤环境中释放不同分泌物来对根际土壤微生物群落进行“招募”和“塑造”，以应对不同的逆境胁迫[5]。关于根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在干旱胁迫中所起作用的研究越来越多，其通过释放胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）增强保水性，ACC脱氨酶抑制植物根部乙烯合成，降低其含量，及脱落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellins，GAs）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）等植物生长调节因子协助植物抵御逆境[6-7]。Mahmoudi等[8]研究表明，小麦幼苗根际定殖假单胞菌，产生的吩嗪类化合物可提高小麦幼苗的抗旱性和抗逆性。Kim等[9]研究表明，石竹根际土壤的菌株肠杆菌EJ01能诱导拟南芥产生脯氨酸，抵御盐胁迫。Shakir等[10]研究表明，干旱条件下接种产ACC脱氨酶的根瘤菌（rhizobia）的小麦与对照相比，其植株的根冠长度和侧根数量都有显著增加，这有利于植物获得更多的水分和养分，缓解乙烯的伤害和干旱胁迫。由此可见，根际促生菌在植物抵御逆境中扮演着十分重要的角色，在农业生产中具有巨大的应用潜力，因此研究在干旱环境下植物对根际有益微生物的影响，并促进微生物在绿色农业生产中的高效利用是当前科研人员关注的重点。

虽然目前关于微生物参与植物耐旱性的重要作用已被广泛认知，但在辣椒中，微生物对水分胁迫有何响应、微生物对异常环境有何指示作用、干旱下辣椒对根际微生物群落结构有何影响等相关方面的研究较少。因此笔者以丘北辣椒为试验材料，研究其在干旱条件下根际细菌群落结构的组成和特征，旨在从微生物角度阐述干旱胁迫对丘北辣椒根际细菌群落的塑造、菌群的响应及微生物的指示作用，挖掘可能在干旱胁迫下对辣椒生长具有正向作用的细菌类群，以期为辣椒抗旱与根际微生物互作及增强抗旱性等研究提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料是文干椒1号，为丘北辣椒地方代表品种，由文山州农业科学院蔬菜研究所提供，具有性状稳定、抗旱能力较强、稳产等特性。种植土壤为丘北县设施大棚的种植红土与育苗基质体积比1∶1进行混合，有效氮含量（w，后同） 301.53 mg·kg-1、有效磷含量 89.34 mg·kg-1、有效钾含量 370.59 mg·kg-1、pH 5.71，土壤最大持水量（灌满水饱和状态下，待土壤中重力水排除后的数值）经托普云农TZS-3X土壤水分检测仪检测为39%。

1.2 试验设计

试验于2022年12月在文山州农业科学院温室大棚内进行。种子经75%乙醇杀菌30 s，纯水冲洗后播于装有土壤的塑料花盆（40 cm×40 cm×40 cm）中，昼夜温度为（27±1） ℃/（23±1）℃，常规管理。待辣椒长到7～10片叶时（移栽期），选取长势一致的辣椒进行干旱处理。试验设置对照（CK，正常种植土壤）和干旱处理（DS），每个处理10盆，3次重复，其中干旱处理含水量为土壤基质最大含水量的60%～70%；对照含水量为土壤基质最大含水量的90%。处理时长为7 d，其间动态监测土壤基质的水分变化，控制各处理的土壤基质含水量保持在既定范围内。

1.3 取样与测定方法

处理结束后，选取叶片萎蔫的辣椒植株，每个处理选择整齐一致的5株混合为1次重复，每个处理3次重复。抖落附着的土壤后，将根系表面的土壤装于50 mL无菌离心管中，-80 ℃保存，用于微生物检测，并收集秧苗叶片和根系（刮取根系土壤后用无菌水冲洗干净），4 ℃保存用于生理指标检测。

参照王灿等[11]的方法测定植株叶片叶绿素、可溶性糖、丙二醛和脯氨酸含量，采用氮蓝四唑法测定根系超氧化物歧化酶（SOD）活性[12]，采用TTC法测定根系活力[13]。

微生物DNA提取、illumina文库构建和高通量测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。PCR体系共30 µL：Phusion Master Mix 15 µL，引物515F（序列：CTGCCAGCMGCCGCGGTAA） 和806R（序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）各3 µL，ddH2O 2 µL，DNA（1 ng·µL-1）7 µL；PCR 反应条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸5 min。文库构建使用NEBNext® Ultra™ IIDNA Library Prep Kit建库试剂盒，将构建好的文库进行Qubit和Q-PCR定量，待文库合格后使用NovaSeq6000上机测序。

1.4 数据质控与分析

根据barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.11， http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）软件对样本的reads进行拼接，得到Raw Tags。然后使用fastp软件对得到的Raw Tags进行质控，得到高质量的Clean Tags。最后使用Usearch软件将Clean Tags与数据库进行比对，以检测嵌合体并进行去除，从而得到最终的有效数据，即Effective Tags。使用QIIME2软件中的DADA2模块进行降噪，并过滤掉丰度小于5的序列，从而获得最终的扩增子序列变异（ASVs）以及特征表。使用QIIME2 feature-table rarefy工具以低样本序列量的97%进行抽平处理。使用QIIME2软件中的classify-sklearn模块将得到的ASVs与数据库比对，从而得到每个ASV的物种信息。

使用QIIME2软件计算Shannon、Simpson、Chao1等α多样性指数，并绘制稀释曲线。多样性指数反映了物种的丰富度和均匀度，数值越大表示物种多样性越高。使用QIIME2软件计算Unifrac距离，并使用R3.6.2软件中ggplot2绘制PCA，使用QIIME2软件中的adonis函数分析组间群落结构的差异显著性。使用LEfSe软件完成LEfSe分析，设置LDA score阈值为4。使用软件Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2（PICRUSt 2）进行同源蛋白簇（Clusters of orthologous groups of proteins，COG）功能预测。其中PICRUSt 2是一种根据Marker基因进行元基因组功能预测的生物信息软件包，可进行COG数据库比对（COG数据库是对基因产物功能进行同源分类、注释的数据库，http：//eggnog.emble.de/），预测样本基因对应的COG，然后对COG进行功能注释、归类以及对应基因丰度计算，从而进行菌群代谢功能预测。