解淀粉芽孢杆菌NTBA分离及对小白菜的促生活性测定

摘    要：为挖掘优良的促生细菌菌株，通过形态学和分子生物学方法对烟草中分离的内生细菌进行鉴定，并测定其对小白菜的促生活性。经鉴定该内生菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名菌株为NTBA。该菌具有解有机磷、解无机磷和解钾活性，并能够产IAA。采用土壤中施入100、10、1 μL菌液的浇灌施菌法和小白菜种子的菌液浸种法，并以浇灌无菌水作为对照，测定对小白菜的促生作用。结果表明，培养10、15和20 d，2种施菌方法处理的小白菜的叶长、叶宽、株高及茎粗均显著高于对照；培养20 d时，3个浓度菌液浇灌处理和菌液浸种处理的小白菜鲜质量分别比对照增加了78.99%、76.08%、70.29%和84.78%，干质量增加了86.44%、76.27%、31.36%和88.98%，最长根长分别增加了118.98%、83.94%、45.99%和63.50%。可见，解淀粉芽孢杆菌NTBA能够明显促进小白菜生长，提高其产量。研究结果可为小白菜生产提供有益的促生菌，也为其他作物生产提供了潜在的促生菌资源。

关键词：解淀粉芽孢杆菌；小白菜；促生

中图分类号：S634.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-123-08

Isolation of Bacillus amyloliquefaciens NTBA and determination of the growth-promoting activity on Chinese cabbage

WANG Mei1， SHANG Chunxiao2， LIU Zhenyu3， LI Xiangying3

（1. Agricultural Technology Extension Center， Fei County Agriculture and Rural Bureau， Feixian 273400， Shandong， China; 2. Agriculture and Rural Bureau， Liaocheng Jiangbei Water City， Liaocheng 252000， Shandong， China; 3. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， Shandong， China）

Abstract： To explore excellent strains of growth promoting bacteria， endophytic bacteria isolated from tobacco were identified using morphological and molecular biology methods， and its growth promoting activity on Chinese cabbage was determined. The endophytic bacterium was identified as Bacillus amyloliquefaciens， and assigned as NTBA. It was found that the bacterium had the activity of hydrolyzing organic phosphorus， inorganic phosphorus and potassium， and could produce IAA. The growth promotion effect on Chinese cabbage was determined by pouring 100 μL， 10 μL and 1 μL bacterial solutions in the soil and by soaking Chinese cabbage seeds with bacterial solution， with sterile water as the control. The results showed that after cultured for 10， 15， and 20 days， the leaf length， leaf width， plant height， and stem diameter of Chinese cabbage treated with the two methods were significantly higher than those of the control. After 20 days of culture， compared with the control， the fresh mass of Chinese cabbage treated by pouring three concentrations of the bacterial solution and soaking seeds with bacterial solution increased by 78.99%， 76.08%， 70.29%， and 84.78%， respectively. The dry mass increased by 86.44%， 76.27%， 31.36%， and 88.98%， respectively. The root growth of Chinese cabbage was increased by 118.98%， 83.94%， 45.99%， and 63.50%， respectively. In conclusion， B. amylolyquenfaciens NTBA can obviously promote the growth of Chinese cabbage and increase its yield. This study provides beneficial plant growth-promoting bacteria for the production of Chinese cabbage and potential growth-promoting bacteria resources for other crops.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens; Chinese cabbage; Growth-promoting activity

蔬菜等作物的产量增加和品质提升是农业生产的重要目标，合理使用肥料是达成此目标的重要方法。一直以来，化学肥料是重要的农用投入品，在农业生产中起到重要作用。随着人们对施用化肥利与弊认识的不断深入，近年来微生物肥料发展迅速且已成为肥料行业最具活力的板块之一[1-2]。挖掘可用于蔬菜等作物生产的微生物资源，已成为科研人员和生产实践者关注的热点[3-5]。

细菌在自然界中种类很多且分布广泛，功能复杂多样，是重要的生态元素也是重要的农业资源。芽孢杆菌属是一类具有良好功能并取得较多应用的细菌资源[6-8]，在促进植物生长[9-10]、植物抗病[11-13]和抗逆[14]等方面发挥了突出作用。研究发现，以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZHRO制成的生物菌肥能够提高甘蔗的生物量，提高根际土壤肥力[15]；解淀粉芽孢杆菌SQ-2具有解磷酸三钙活性和固氮能力，具有对水稻的促生活性[16]；解淀粉芽孢杆菌DGL1具有一定的降解纤维素活性，具有促进牧草种子萌发和幼苗生长的能力[17]。张开祥等[18]研究也发现，解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂可使小白菜增产15.44%。上述研究表明，解淀粉芽孢杆菌对多种作物具有良好的促生作用，发掘和利用该类菌株具有重要意义。

解淀粉芽孢杆菌广泛存在于土壤、植物表面和体内，开展从不同生境中获取有价值的菌株，并尝试用于作物生产的研究有重要意义。笔者的研究即尝试从烟草中获取内生细菌，并以小白菜为试材，探究菌株对小白菜的促生作用，以期为小白菜乃至其他作物生产提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 细菌的分离和鉴定

1.1.1 细菌的分离与纯化 所用细菌菌株分离自成株期健康烟草茎秆，烟草茎秆采集自山东省诸城市贾悦镇琅埠烟田，采集时间为2017年9月，保存于超低温冰箱备用。将烟草茎秆切成长度5 cm左右的小段，75%酒精浸泡1 min后，用无菌水冲洗3次，再用酒精外焰轻烧表面灭菌10 s，将髓部组织纵向切成2 mm×2 mm薄片，并接种到LB固态培养基上，28 ℃培养3 d。根据细菌菌落特征，选取细菌单菌落，在LB固态培养基划线培养，28 ℃培养3 d。挑取单菌落置于5 mL的LB培养基中，在28 ℃、200 r·min-1的条件下振荡培养24 h，命名为NTBA，于-80 ℃保存备用。

1.1.2 细菌的鉴定 细菌鉴定试验于2018年5月开展，地点为山东农业大学农业微生物重点实验室。

将菌株NTBA接种到LB固态培养基上，28 ℃培养3～5 d，采用体式荧光显微镜观察菌落特征并拍照，采用革兰氏染色法，观察细菌菌体形态和芽孢特征。

菌株分子鉴定：在LB培养基中培养细菌，获得菌体，提取菌体基因组DNA。以菌体DNA为模板，PCR扩增该菌株16S rRNA、gyrA和rpoB基因片段。16S rRNA基因的引物对为27f （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r （5'-CGGTGTGTACAAGGCCC-3'）；gyrA的引物对为gyrA-F （5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'）和gyrA-R （5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'）；rpoB的引物对为rpoB 2292f-F （5'-GACGTGGATGGCTACAACT-3'）和rpoB 3354r （5'-ATTGTCGCCTTTAACGATGG-3'）。反应体系：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃复性40 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。电泳检测，将获得的16S rRNA、gyrA和rpoB基因片段测序，并将16S rRNA、gyrA和rpoB基因序列进行BLASTn，根据BLASTn结果，利用MEGA 11软件，基于最大似然法（Maximum Likelihood）进行多基因联合系统发育树构建。

1.2 解磷、解钾及产IAA活性测定

试验开展于2018年5—8月，地点为山东农业大学农业微生物重点实验室。

1.2.1 解磷活性测定 参照张玉苗[19]的方法测定菌株NTBA解磷活性。配制解无机磷培养基和解有机磷培养基。将活化好的菌悬液2 μL点接于解磷培养基中，28 ℃培养120 h，观察测定透明圈大小，测量透明圈（即溶磷圈）直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值。试验设3次重复。

1.2.2 解钾活性测定 参照文献[20-21]的方法检测NTBA的解钾活性。取NTBA菌悬液2 μL点接在钾长石粉的培养基上，28 ℃培养120 h，测量透明圈（即解钾圈）直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值。试验设3次重复。

1.2.3 产IAA活性测定 将细菌接种在含200 mg·L-1 L-色氨酸R2A培养基中，28 ℃、200 r·min-1培养3和5 d，然后使用Salkowski方法测定IAA活性[22]。将未接种细菌的含有200 mg·L-1 L-色氨酸的R2A培养基，在28 ℃培养3和5 d，作为阴性对照。将细菌以10 000 r·min-1离心，将上清液与Salkowski试剂混合。利用酶标仪测定530 nm处光密度值。试验设3次重复。用0、5、10、20、40和60 mg·L-1 IAA的光密度值生成标准曲线。

1.3 菌株NTBA对小白菜的促生试验

试验开展于2018年5—8月。地点为山东农业大学农业微生物重点实验室，小白菜盆栽试验在实验室光照培养箱中开展。