平沙绿僵菌SG-A两种培养基比较及其对瓜绢螟的致病活力

摘    要：为比较平沙绿僵菌SG-A在两种培养基上的生物学特性及对瓜绢螟不同虫态的致病力，室内测定了平沙绿僵菌SG-A在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和萨氏培养基（SDAY）上培养14 d后的菌落大小、产孢量及孢子萌发率等指标，并采用浸虫法测定了对瓜绢螟不同虫态的致病力。结果表明，平沙绿僵菌SG-A在PDA培养基中培养14 d后的产孢量显著高于SDAY培养基，菌落大小和孢子萌发率差异不显著。平沙绿僵菌SG-A对瓜绢螟2龄、4龄幼虫和蛹均存在较高的致病力，孢子浓度越大，致病力越高，其中对蛹的致病力最高，LC50为1.93×105 个·mL-1，当孢子浓度为1×108 个·mL-1时，处理8 d蛹的累积死亡率为90%，2龄和4龄幼虫的累积死亡率也分别达到86.67%和83.33%，但4龄幼虫出现死亡的时间要早于蛹和2龄若虫，LT50为2.60 d。综上所述，平沙绿僵菌SG-A对瓜绢螟各虫态均具有较高的致病力，可进一步挖掘其生防潜力。

关键词：平沙绿僵菌；SG-A菌株；瓜绢螟；生物学特性；致病力

中图分类号：S476.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-152-06

Comparison of two culture medium of Metarhizium pingshaense SG-A and its pathogenic activity against Diaphania indica（Saunders）

HU Haiyan， ZHANG Ranran， WANG Yali， LI Xiaoli， DUAN Huiting

（Weifang University of Science and Technology/Shandong Provincial University Laboratory for Protected Horticulture， Shouguang 262700， Shandong， China）

Abstract： In order to compare the biological characteristics and pathogenicity of Metarhizium pingshaense SG-A on two media， the size of colony， sporulation yield and spore germination rate of M. pingshaense SG-A on potato glucose AGAR medium（PDA）and sabouraud dextrose agar with yeast extract（SDAY）were measured after 14 days. The pathogenicity of M. pingshaense SG-A against different insect states of Diaphania indica（Saunders）was determined by dip method. The biological characteristics on different media and pathogenicity to D. indica of M. pingshaense SG-A were measured . The results showed that the spore production of M. pingshaense SG-A after 14 days of PDA culture was significantly higher than that of SDAY culture medium， and there was no significant difference in colony size and spore germination rate. M. pingshaense SG-A showed high pathogenicity against the 2nd and 4th instar larvae and pupae， and the pupae had the highest pathogenicity. The LC50 was 1.93×105 conidia·mL-1， and the cumulative mortality of pupae was 90% when the spore concentration was 1×108 conidia·mL-1. The cumulative mortality of 2nd instar and 4th instar larvae also reached 86.67% and 83.33%， respectively， but the death time of 4th instar larvae was earlier than that of pupa and 2nd instar nymphs， and the LT50 was 2.60 days. In conclusion， M. pingshaense SG-A has high pathogenicity against each species of D. indica， which can further explore its biocontrol potential.

Key words： Metarhizium pingshaense; SG-A strain; Diaphania indica（Saunders）; Biological characteristics; Pathogenicity

瓜绢螟[Diaphania indica（Saunders）]是危害设施蔬菜的重要害虫之一，其中葫芦科植物是其嗜食的主要寄主，特别是在黄瓜、丝瓜、苦瓜等寄主上的危害逐年加重[1]。在温室适宜的环境条件下，瓜绢螟单雌产卵量可达500粒，常年危害植物叶片和果实，尤其3龄后食量暴增，吐丝缀合叶片或嫩梢后藏匿其中，每个叶片上有几十头幼虫取食，危害严重时可将叶片全部吃光[2]。目前，关于瓜绢螟的防治主要采用化学药剂，但长期单一地采用化学药剂会导致瓜绢螟的抗药性逐渐增强。因此，亟待寻找一条绿色高效的防治途径，生物防治已逐渐被人们所重视，广泛应用于保护地蔬菜害虫的防治，虫生真菌就是化学农药控制害虫的重要替代品，其中绿僵菌（Metarhizium spp.）是目前应用最广泛的虫生真菌之一，绿僵菌种类较多，已经被证实对多种害虫均有较高的防治效果。林华峰等[3]研究表明，绿僵菌大孢变种在进行土壤和喷雾处理蛴螬后的累积僵虫率分别达88.23%和76.47%。Zhao等[4]研究表明，平沙绿僵菌MaFZ-13侵染茶尺蠖后的死亡率达93%。裴松松等[5]利用紫外诱变得到的金龟子绿僵诱变菌株F2-M18-8-4对西花蓟马的校正虫口减退率为79.52%，显著高于吡虫啉、噻虫嗪及乙基多杀菌素的防治效果。Peng等[6]研究表明，金龟子绿僵菌CQMa421施用7 d后对稻飞虱的防效在60%以上。另外，还有较多关于绿僵菌防治飞蝗、叶甲等害虫的研究报道[7-8]。但目前关于平沙绿僵菌对瓜绢螟致病性的研究还未见报道。笔者选择前期分离筛选到的1株平沙绿僵菌菌株SG-A （Metarhizium pingshaense SG-A），通过比较马铃薯葡萄糖琼脂培养基和萨氏培养基对平沙绿僵菌菌株SG-A生长和产孢等指标的影响以及对瓜绢螟不同虫态的致病力，以期为瓜绢螟的生物防治提供菌种资源和应用依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌种：菌株SG-A是通过采集寿光市学府蔬菜有限公司露天种植的烟薯25田块地表以下20 cm的土壤样品，以黄粉虫诱集法并分离纯化后获得[9]，经形态学和分子生物学鉴定，确定为平沙绿僵菌（Genebank登录号为：OR900300）。

供试昆虫：瓜绢螟幼虫于2023年4月采自寿光市稻田镇西里村黄瓜大棚植株上，并带回室内饲养多代后取龄期一致的2龄、4龄幼虫以及蛹备用。

1.2 方法

试验于2023年8—9月在潍坊科技学院进行。

1.2.1 不同培养基对平沙绿僵菌SG-A菌落生长的影响 试验采用菌液点滴法[3]，刮取平板中的分生孢子，使用含有0.05%吐温-80的无菌水配成1×108 个·mL-1的孢子悬浮液，用无菌移液枪移取2 μL孢子悬浮液分别接种到萨氏培养基（SDAY：10 g·L-1蛋白胨、40 g·L-1葡萄糖、10 g·L-1酵母提取物及20 g·L-1琼脂）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：马铃薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1及琼脂20 g·L-1）的无菌平板中央，将含有孢子悬浮液的培养皿使用封口膜封好后放置于培养箱中黑暗培养，培养箱中温度保持在（25±1）℃，湿度为（70±5）%。培养3 d后，挑选含有单菌落的培养皿以十字交叉法测定菌落直径，每个处理5次重复，每隔2 d测定1次，培养14 d后测定结束，计算菌落日增长量，同时观察记录两种培养皿的菌落颜色、菌落形态等特征。

1.2.2    不同培养基对平沙绿僵菌SG-A产孢量的影响    平沙绿僵菌SG-A菌落培养14 d后，用0.5 cm直径的无菌打孔器分别在SDAY和PDA培养基菌落直径1/2处打取菌蝶，置于50 mL的锥形瓶中，加入20 mL灭菌的吐温-80溶液，使用磁力搅拌器将孢子块充分打散，使孢子均匀分布，然后用血球计数板在生物显微镜下统计不同培养基上的产孢量，每个处理至少5次重复。

按照刘宝生等[10]的方法统计产孢量：1 cm2 菌落孢子数量＝（平均每个小格孢子数量×4×106×稀释倍数）/（3.14×r2×n），r为菌落半径（cm），n为菌落的数量（块）。

1.2.3    不同培养基对平沙绿僵菌SG-A孢子萌发率的影响    首先配制1×107个·mL-1的孢子悬浮液，在含有10 mL SDAY和PAD培养基的锥形瓶中分别加入1 mL的孢子液，放入恒温振荡器中振荡培养24 h，然后吸取适量菌液滴加到血球计数板上观察孢子萌发情况，以芽管长度＞孢子半径的孢子视为已萌发孢子[11]，每个处理至少5次重复，每次观察孢子数量不少于200个，计算孢子萌发率。孢子萌发率/%=萌发孢子数/孢子总数×100。

1.2.4    平沙绿僵菌SG-A对瓜绢螟幼虫及蛹的致病力    试验采用浸虫法[5]，先用含有0.05%吐温-80的无菌水配制孢子悬浮液，从高浓度往低浓度依次稀释，配制时用磁力搅拌器将孢子搅拌均匀，配制浓度依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104个·mL-1。然后分别挑选龄期一致的瓜绢螟2龄、4龄幼虫及蛹，将瓜绢螟幼虫及蛹分别浸入到不同浓度的孢子悬浮液中2～3 s后取出，在无菌滤纸上晾干多余药液后，将瓜绢螟幼虫分别放入含有幼嫩黄瓜叶片的一次性塑料盒中饲养，保鲜膜封口后扎眼透气，将瓜绢螟蛹放入含有湿润滤纸的一次性塑料盒中，以含有0.05%吐温-80无菌水作为空白对照，每个处理至少5次重复，每个重复10头试虫，将处理好的试虫放入培养箱中观察饲养，培养箱温度（25±1） ℃，湿度（70±5）%，光周期为L∶D=12 h∶12 h。每天观察瓜绢螟幼虫和蛹的存活情况，以细毛笔触碰幼虫虫体不动即视为死亡，触碰蛹的腹部末端不动也视为蛹已死亡，将死亡僵硬的幼虫和蛹放到含有湿润无菌滤纸的玻璃培养皿中保湿培养，镜检如果有绿僵菌菌丝和孢子长出即为绿僵菌感染导致的死亡，统计每个处理感染死亡的幼虫和蛹的数量，计算死亡率和校正死亡率。死亡率/%=死虫数/供试虫数×100。校正死亡率/%=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100。