不同生长阶段香菇栽培料木质纤维素降解利用研究

摘    要：为深入了解香菇生长发育过程中栽培料木质纤维素的变化，对不同生长阶段香菇栽培料中木质纤维素含量及其相关降解酶活性进行了测定，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X-射线衍射法（XRD）和显微镜观察研究了木质纤维素微观结构分子基团、纤维素相对结晶度（CrI）和纤维表面形态的变化。结果表明，在香菇生长发育过程中，栽培料中的纤维素、半纤维素和木质素含量显著下降，木质纤维素含量（w，后同）由85.27%降低至52.23%，其与相应的降解酶系活性负相关，木质纤维素降解与纤维破坏程度呈现一定的相关性。FTIR结果显示，不同生长阶段香菇栽培料中木质纤维素特征官能团峰值发生变化，木质素降解速率高于半纤维素、低于纤维素。随着香菇的生长发育，栽培料中CrI显著降低，纤维素晶体结构受到了一定程度的破坏。结果表明，香菇首先利用栽培料中非木质纤维素组分供菌丝生长，同时分泌胞外降解酶破坏纤维结构，将大分子组分降解为小分子组分，从而满足其生长所需，高木质纤维素降解酶活性对应高木质纤维素降解率。该研究结果可为促进香菇栽培料中木质纤维素的降解利用提供依据。

关键词：香菇；木质纤维素；胞外酶；结晶度；红外光谱；纤维形态

中图分类号：S646.1+2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）09-102-07

Study on the degradation and utilization of lignocellulose in cultivation materials of Lentinus edodes at different growth stages

LI Shunfeng， LIU Li’na， XU Fangfang， TIAN Guangrui， CUI Guomei， GAO Shuaiping， WEI Shuxin， WANG Anjian

（Research Center of Agricultural Processing Science and Technology， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to deeply understand the characteristics of lignocellulose variation in Lentinus edodes culture during the growth and development periods， the lignocellulose content and its related degrading enzyme activity in cultivation materials of L. edodes at different growth stages were determined. The changes of molecular groups of lignocellulose， relative crystallinity index（CrI）of cellulose and fiber surface morphology were also studied and observed by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）， X-ray diffraction（XRD）， and microscope. The results showed that the content of cellulose， hemicellulose and lignin decreased significantly during the growth of L. edodes. The content of lignocellulose decreased from 85.27% to 52.23%， which was negatively correlated with the activity of the corresponding degrading enzyme， and the degradation of lignocellulose showed a certain correlation with the degree of fiber damage. The FTIR results showed that the absorbance of characteristic functional groups of lignocellulose in different growth stages had changed， and the degradation rate of lignin was higher than hemicellulose and lower than cellulose. With the growth of L. edodes， the CrI in cultivated materials decreased significantly， and the crystal structure of cellulose was destroyed to some extent. The results showed that the L. edodes was used the non-lignocellulosic components in cultivation materials for mycelium growth firstly， and secreted extracellular degrading enzymes to destroy the fiber structure and degrade the macromolecular components into small molecular components at the same time， thus meeting its growth needs. The high activity of lignocellulose degrading enzymes corresponds to the high degradation rate of lignocellulose， and the results can provide a basis for improving the degradation and utilization of lignocellulose in L. edodes cultivation materials.

Key words： Lentinus edodes; Lignocellulose; Extracellular enzymes; Crystallinity; FTIR spectra; Fiber morphology

收稿日期：2024-01-06；修回日期：2024-04-17

基金项目：河南省农业科学院自主创新项目（2023ZC079）；河南省重点研发专项（231111112500）；河南省科技攻关计划项目（232102110278）；河南省农业科学院科技创新团队专项（2023TD41）

作者简介：李顺峰，男，副研究员，主要从事食用菌保鲜加工与栽培生理等研究工作。E-mail：lishunfeng2000@163.com

通信作者：王安建，男，研究员，主要从事农产品保鲜与加工研究工作。E-mail：309294051@qq.com

香菇是我国食用菌栽培量和产量最大的食用菌，我国70%以上省份均栽培香菇。香菇是典型的木腐菌，其生长所需营养要靠栽培基质提供，以木屑为主栽料的代料栽培是香菇栽培的最主要形式。香菇栽培基质以木屑为主，辅以麦麸或米糠，这些原料中均含有大量的木质纤维素，其含量接近80%，是香菇生长发育的主要营养源，为香菇生长发育提供必需的大分子碳源，木质纤维素的充分降解和利用对香菇的生长发育至关重要[1-2]。木质纤维素由木质素、半纤维素和纤维素三部分组成，它们相互缠绕形成一道天然屏障，严重阻碍了木质纤维素的降解和利用[3-4]。木质纤维素是大分子物质，只能在被分解成小分子物质后才能被食用菌吸收利用。

食用菌在生长发育过程中菌丝不断向其周围环境中分泌多种胞外酶[5-6]，将栽培基质中的纤维素等大分子物质降解成为小分子物质，以便吸收利用。胞外酶是食用菌生长发育的关键因素之一，由于其分泌量有限，且分泌具有阶段性，导致栽培基质的利用率受到一定限制，影响产量的提高。有研究通过添加外源酶类，利用生物转化促进栽培基质降解的，提高食用菌对栽培基质的利用率[7-8]。现有研究多集中在香菇栽培中胞外酶活性的变化方面，鲜见对香菇不同生长阶段的胞外酶活性变化与木质纤维素降解的联合研究报道[9-11]。因此，为了提高栽培基质的生物转化率，笔者通过检测香菇不同生长时期栽培料中木质纤维素的降解以及相关降解酶活性的变化，并采用X-射线衍射检测纤维素结晶度以及电子显微镜对栽培料纤维形态变化进行观察，旨在深入了解不同生长期香菇栽培料中木质纤维素的变化特征，为提高栽培料利用率和解析栽培料中木质纤维素降解利用机制提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

栎木屑和香菇CCL10菌种由洛阳双惠菌业有限公司提供；麸皮购自新乡市明阳面粉厂；栽培料配方：木屑78%、麸皮20%、石膏1%、石灰1%，基质含水量55%。

1.2 方法

1.2.1 香菇栽培与取样 按照河南省地方标准《春栽香菇代料栽培技术规程》（DB41/T 2048―2020）和河南省农学会团体标准《香菇全产业链标准化生产 第5部分：优质香菇出菇管理技术规程》（T/HAASS 0006―2023）进行香菇的栽培与管理。香菇栽培试验于2022年3―6月在河南现代农业研究开发基地进行，分别于接种后50 d（菌丝长满菌袋：满袋期，S1）、70 d（完成转色：转色期，S2）、80 d（出现菇蕾：现蕾期，S3）、115 d（第1茬菇采收完成：子实体采收期，S4）4个时期进行取样。在每个生长时期各随机挑选9个栽培袋，每3个栽培袋培养料揉碎混匀后作为1个样品，以灭菌后未接种香菇菌种的栽培料记为S0，用于后续相关指标测定。

1.2.2 木质纤维素含量测定 参照Van等[12]与Van[13]的方法测定并计算纤维素、半纤维素和木质素含量。

1.2.3 X-射线衍射分析 取适量过60目筛网的不同生长阶段香菇栽培料粉末，均匀平铺在有凹槽的玻璃片上，将玻璃片放在X-射线衍射仪的扫描台上，分析纤维素的相对结晶度。使用Cu Kα射线，电压和电流分别为40 kV和40 mA，扫描范围5°～50°，扫描速度为5°·min-1，获得X-射线衍射图[14-15]。采用Segal等[15]的方法计算纤维素相对结晶度（Crystallinity Index，CrI）。

1.2.4 傅里叶变换红外光谱分析 称取过60目筛网的不同生长阶段香菇栽培料粉末各10 mg，与2 g经过干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨均匀，压片后用傅里叶红外光谱仪在400～4000 cm-1（仪器分辨率4 cm-1）下扫描采样64次[16]。所得结果用Omnic 9.2软件分析。

1.2.5 木质纤维素酶活性的测定 酶液提取：鲜样冷冻后进行冷冻粉碎，称取2 g样品粉末加入10 mL去离子水，上下振摇30 min，经尼龙过滤后，10 000 r·min-1离心15 min（4 ℃），收集上清液用于酶活性测定[5]。

酶活性测定：按照Huang等[17]的方法测定羧甲基纤维素酶活性，参照管婉等[18]的方法测定β-葡萄糖苷酶活性；参照刘芹等[19]的方法测定木聚糖酶活性、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性。

1.2.6 纤维形态观察 将不同生长阶段香菇栽培料放入试管内，加入双氧水和冰醋酸混合液（体积比1∶1），混合液没过试样2 cm左右，置于水浴锅中沸水煮至样品变白，呈透明状。将煮好的试样用蒸馏水冲洗数遍至不呈酸性为止，再加入适量蒸馏水至试管，振荡，使试样全部分离成单根纤维[14，20-21]。吸取此纤维悬浮液滴于载玻片上，利用光学显微镜和MSShot图像处理系统对纤维进行拍照观察。

1.3 数据处理

采用Excel 2019对数据进行整理计算，采用SPSS 25.0对数据进行组间显著性差异分析，结果以平均值±标准差表示。采用OriginPro 2021和Excel 2019作图。