中国南瓜CmoAux/IAA基因的克隆和表达特征分析

摘 要：在前期对中国南瓜败育雌蕊和正常雌蕊进行转录组分析发现，CmoAux/IAA基因可能参与了雌花发育，为进一步探究其生物学功能，利用同源序列克隆法从中国南瓜中克隆得到全长为600 bp的CmoAux/IAA基因，该基因编码199个氨基酸；保守结构域分析结果表明，其属于Aux/IAA家族，包含结构域Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ；该蛋白无信号肽和跨膜结构。多序列比对和系统进化树分析结果显示，CmoAux/IAA氨基酸序列与印度南瓜XP_022986212.1的氨基酸序列、美洲南瓜XP_023513171.1的氨基酸序列亲缘关系较近，相似度高达98.01%、96.50%。拟南芥原生质体亚细胞定位结果显示，CmoAux/IAA蛋白定位于细胞核和细胞质。实时荧光定量结果显示，该基因具有组织表达特异性，主要在南瓜植株生长点及雌花柱头中表达，柱头中的相对表达量是雄蕊的137倍，在叶和根中不表达，其可能在植株生长点幼嫩组织分化或雌花发育过程中发挥着重要作用。

关键词：中国南瓜；Aux/IAA；基因克隆；生物信息学分析；亚细胞定位

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）10-030-08

收稿日期：2024-04-29；修回日期：2024-07-07

基金项目：国家自然科学基金（32302559）；河南省科技攻关项目（242102110312）；河南省高等学校青年骨干教师培养计划（2024GGJS102）；河南省重大科技专项（241100110200）

作者简介：任广乾，男，助理研究员，主要从事瓜类品种选育研究工作。E-mail：1491748031@qq.com

共同第一作者：刘正响，男，在读硕士研究生，主要从事南瓜重要农艺性状基因挖掘研究工作。E-mail：liuzhengxiang33@163.com

通信作者：李庆飞，副教授，主要从事蔬菜种质资源创新与利用研究工作。E-mail：lqf_20131025@126.com

Cloning and expression analysis of CmoAux/IAA gene in Cucurbita moschata

REN Guangqian1， LIU Zhengxiang2， HAN Yuanyuan2， CHEN Bihua2， LI Xinzheng2， LI Qingfei2

（1. Xinxiang City Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. College of Horticulture and Landscape， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China）

Abstract： In the previous study， transcriptomic analysis of abortive pistil and normal pistil of Cucurbita moschata found that CmoAux/IAA gene might be involved in female flower development. In order to further explore its biological function， a 600 bp gene（CmoAux/IAA） was cloned from Cucurbita moschata by homologous sequence cloning method and it encodes 199 amino acids. The results of conserved domain analysis showed that it belongs to the Aux/IAA family and includes domains Ⅰ， Ⅲ， and Ⅳ. The protein has no signal peptide and transmembrane structure. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree results showed that the amino acid sequence of CmoAux/IAA were closely related to XP_022986212.1 of Cucurbita maxima and XP_023513171.1 of Cucurbita pepo， and the similarity was 98.01% and 96.50%， respectively. The results of subcellular localization of Arabidopsis protoplasts showed that the protein was located in nucleus and cytoplasm. Real-time fluorescence quantitative results showed that CmoAux/IAA has tissue expression specificity， mainly expressed in the growing points and stigma of female flowers in pumpkin plants， and the expression level of CmoAux/IAA in stigma was 137 fold that of in stamen， but not expressed in leaves and roots and it may play an important role in the differentiation of young tissue or the development of female flowers.

Key words：Cucurbita moschata; Aux/IAA; Gene cloning; Bioinformatics analysis; Subcellular localization

南瓜为葫芦科南瓜属一年生蔓生草本植物，是一种集食用、药用、观赏兼加工的蔬菜作物[1]，在世界各地广泛栽培，主要栽培种有中国南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）、美洲南瓜（Cucurbita pepo）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia），其中，中国南瓜栽培范围最广泛。我国是南瓜生产大国，据2022年FAO（https：//www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL）统计，我国南瓜年栽培面积约39.8万hm2，年总产量737.8万t，均居世界第一位。提高南瓜产量是增加经济效益的有效途径，而雌花与产量息息相关，因此，研究南瓜雌花发育相关基因具有重要意义。

生长素是植物最重要的激素之一，在生长发育过程中具有重要作用，包括细胞分裂、叶片延伸、开花模式、顶端优势、向性生长和抗逆性等[2]。植物生长素信号转导途径包括信号识别、下游生长素相关基因的表达以及植物的生理反应等，下游生长素相关基因又称为早期/原初响应基因，主要包括生长素/吲哚-3-乙酸（auxin/indole-3-acetic acid，Aux/IAA）、生长素响应因子（ARF）、GH3（gretchen hagen 3）和SAUR（small auxin-up RNA）等基因家族[3-4]。Aux/IAA蛋白通常包含4个保守结构域[3，5]。结构域Ⅰ含有“LxLxLx”（亮氨酸重复单元）基序，该基序与乙烯响应因子相关，是Aux/IAA蛋白转录抑制功能不可缺少的一部分[6]。结构域II具有保守的“GWPP”基序，主要负责Aux/IAAs的生长素依赖性降解[7-8]。结构域III和结构域IV包含一个羧基端PB1（Phox和Bem1）结构域，该结构域也位于ARFs的羧基端，负责Aux/IAA和ARF蛋白之间的同源和异源二聚化[9-10]；结构域Ⅲ由三部分组成（β、α1和α2）[11]。结构域IV包含1个保守基序（GDVPW）和1个保守的SV40型核定位信号（NLS：KRxRxxK），有助于二聚化[12-13]。在结构域I和II之间发现的双向保守NLS将Aux/IAA蛋白引导到细胞核中，比SV40型NLS更有效[11，14]。同时具有4个结构域的蛋白称为典型的Aux/IAA蛋白，而至少缺1个结构域的Aux/IAA蛋白被称为是非典型的Aux/IAA蛋白，这种非典型的Aux/IAA蛋白在植物中普遍存在，且在植物生长发育过程中发挥着重要作用[15-17]。Aux/IAA是一种转录抑制因子，通过与参与生长素基因表达响应的ARFs结合抑制下游基因的表达[18]。生长素调控着Aux/IAA蛋白的降解，低浓度生长素抑制ARF转录，调节生长素诱导的基因表达；高浓度生长素使Aux/IAA发生降解，减轻了Aux/IAA对ARF的抑制作用，使其参与到下游靶基因的调控[19-20]。在拟南芥中，Aux/IAA家族基因IAA8与ARF6和ARF8互作，影响下游生长素诱导基因的表达[21]；而ARF6和ARF8在柱头、萼片、花丝及花瓣等花器官中均有表达[22]，通过影响茉莉酸含量可调控花药开裂影响授粉[23]；因此，Aux/IAA间接参与调节拟南芥花器官的发育。在番茄中，SIIAA27表达下调会降低胚珠和花粉育性，而敲除SIIAA27基因则在影响根发育的同时也会降低叶片中的叶绿素含量[24]。与野生型相比，稳定的IAA16突变体使得花丝伸长率下降[25]。

南瓜是雌雄异花同株植物，是研究雌雄花发育的有利材料，但相比黄瓜、甜瓜等同科作物，南瓜雌花发育研究相对落后。河南科技学院南瓜种质资源研究课题组前期研究发现，1个CmoAux/IAA基因在中国南瓜败育雌蕊中下调表达，推测其可能与雌花发育有关，且南瓜中尚未见有关CmoAux/IAA基因的报道。笔者对该基因进行克隆、亚细胞定位及生物信息学分析，并研究了该基因在不同组织和不同花结构中的表达模式，研究结果将有助于深入探究CmoAux/IAA基因的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验于2021年5月至2022年5月在河南科技学院园艺园林学院实验室及基地进行。试验所用植物材料为河南科技学院南瓜课题组提供的中国南瓜自交系2018-3-1。

1.2 方法

1.2.1 中国南瓜CmoAux/IAA基因的克隆 采用试剂盒进行南瓜材料总RNA提取以及cDNA第一链合成，依据中国南瓜基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/organism/9）中同源基因的CDS序列设计引物，引物序列为：CmoAux/IAA-F（CATCTAGAATGGAGCCTAATCAGTTCT）、CmoAux/IAA-R（ACCTCGAGATTTTGATGAATGGCA）。以cDNA为模板进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收CmoAux/IAA基因片段连接至pMD19-T载体，转入大肠杆菌DH5α，将阳性菌液进行测序，选择测序无误的菌液进行后续试验。

1.2.2 CmoAux/IAA基因的生物信息学分析 利用Deep TMHMM预测跨膜结构；利用ExPASy ProParam tool预测CmoAux/IAA蛋白的分子质量、理论等电点pI、平均亲水性和不稳定系数等理化性质；Net Phos3.1 Serve预测CmoAux/IAA蛋白的磷酸化位点；NPS@：SOPMA预测CmoAux/IAA蛋白的二级结构；SignalP 6.0 Server预测CmoAux/IAA基因编码蛋白的信号肽；NCBI-CDS预测保守结构域；NCBI BLAST进行同源性比对分析；DNAMAN 6.0软件进行多序列比对分析，MEGA 7.0构建系统进化树。所用工具网站见表1。