顶坛花椒雄花花粉形态扫描电镜观测及生活力测定

摘    要：以顶坛花椒花为试验材料，使用Eclipse E200生物显微镜和EM-30 Plus型扫描电镜对其花样品进行形态学观察和花粉活力分析，旨在为顶坛花椒杂交育种提供科学依据。结果表明，顶坛花椒出现雌雄同株的现象，花粉成熟后花药呈鲜黄色，花粉粒为长球形，表面具细网状纹饰。不同单株花粉粒直径存在显著差异，其中1号单株的花粉粒直径最大（522.32 μm），3号单株的花粉粒直径最小（279.50 μm）。花粉的极轴长、赤道轴长、花粉大小及网孔直径的平均长度分别为26.76、16.39、442.56和0.81 μm。花粉活力测试结果表明，1号和2号单株的花粉活力较高，亚历山大染色率分别为44.37%和48.57%，但植株长势较弱；5号单株的花粉活力较弱，亚历山大染色率仅有6.67%，但整个植株长势正常，无衰弱迹象。研究结果可为顶坛花椒繁殖策略的制定提供生物学依据。

关键词：顶坛花椒；形态构造；花粉粒大小；花粉活力

中图分类号：S573+.9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）10-0118-06

收稿日期：2023-05-10；修回日期：2024-08-21

基金项目：贵州省科技厅中药现代化项目（黔科合ZY字〔2012〕3002号）；贵州省林业厅项目（黔林科合2018〔01〕）；贵州省科技厅成果转化项目（黔科合成果〔2019〕4233号）；贵州省科技厅优秀青年科技人才项目（黔科合平台人才[20195643]）；贵州省科技厅科技支撑项目（黔科合支撑〔2021〕222号，黔科合支撑〔2022〕一般118号）

作者简介：罗    辉，男，高级工程师，主要从事经济林栽培研究。E-mail：785486162@qq.com

通信作者：王    港，男，副研究员，主要从事林木遗传育种研究。E-mail：417328697@qq.com

Scanning electron microscopic observation and viability test of pollen grains of Zanthoxylum planispinum var. dintanensis

LUO Hui1， ZENG Qinmeng2， LU Zhongke2， HOU Na2， LOU Li2， WANG Gang2

（1. Guizhou Extension Station of Forestry Science and Technology， Guiyang 550001， Guizhou， China; 2. Guizhou Academy of Forestry Sciences， Guiyang 550005， Guizhou， China）

Abstract： The morphological observation and， pollen vitality analysis of the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis flower were conducted using an Eclipse E200 biological microscope and an EM-30 Plus scanning electron microscope. This study aimed to provide a scientific basis for the hybrid breeding of Zanthoxylum bungeanum. The results showed that there was a phenomenon of monoecious growth in the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis. Upon maturation， the anthers turned bright yellow， and the pollen grains were elongated spheres with fine mesh patterns on the surface. Significant variations were observed among different individual plants， specifically， the pollen grain diameter of No. 1 was the largest（522.32 μm）， while that of No. 3   was the smallest（279.50 μm）. The average length of the polar axis， equatorial axis， pollen size， and mesh diameter of the pollen were 26.76， 16.39， 442.56， and 0.81 μm， respectively. Pollen vitality tests revealed that No. 1 and No. 2 exhibited high vitality， with Alexander staining rate of 44.37% and 48.57%， respectively， although their associated plant growth was relatively weak. Conversely， the pollen vitality of Individual No. 5 was low， with an Alexander staining rate of only 6.67%， while the overall growth of the plant appeared normal with no signs of weakening. These research findings provide a biological basis for understanding the reproductive strategy of the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis.

Key words： Zanthoxylum planispinum var. dintanensis; Morphological structure; Pollen size; Pollen vitality

顶坛花椒（Zanthoxylum planispinum var. dintanensis）是竹叶椒（Zanthoxylum planispinum）的一个变种[1]，为芸香科花椒属植物，单性花，花序上所有小花均为雌花，无雄花，大多为纯雌株。顶坛花椒在贵州当地广为栽培，已成为重要的经济林木，对当地的生态环境修复发挥着重要作用[2]。近年来，许多学者对顶坛花椒开展了深入研究，主要集中在营养元素[3]、生理[4]、土壤养分[5]等领域，但对顶坛花椒花粉活力方面的研究较少。花粉是植物的特有器官，是植物种质保存、杂交育种及交换的重要材料[6]。不同植物的花粉经过演化和发展形成了独特的形态特征，即便是在同一种内的花粉，其生活力和形态也具有多样性[7]。花粉的形态特征主要受内环境的影响，通常由基因控制，具有较强的遗传稳定性及保守性[8]，可为系统发育、识别和植物种类的鉴定提供科学依据，并在分类学及遗传学中广泛应用[9]。

无融合生殖是一种特殊的无性繁殖方式，在不经过雌雄配子融合的情况下产生种子，并能培育为成熟个体。这种生殖方式能够使植物的基因型保持不变，从而固定杂种优势，对作物育种具有极其重要的意义。无融合生殖在植物中的表现形式多样，包括营养的无融合生殖、无融合结子等类型，其遗传机制复杂，受多种途径调控[10]。花椒属植物普遍具有一个重要的生物学特性——无融合生殖，即雌性植株不需要经过受精，直接由珠心细胞发育成胚，进而繁殖后代[11]。刘映红等[12]研究表明，野花椒有正常的花粉，且花粉具有活力；叶萌等[13]对青花椒进行6年的观察，发现四川金阳地区的青花椒均为纯雌株，无雄花，而四川峨眉山市、洪雅县、雅安市雨城区有极少的藤椒存在雄花；李立新等[14]对花椒进行遗传多样性分析，发现由于花椒是无融合生殖方式，因此种群内变异较小。Fei等[15]通过细胞学观察、分子标记以及倍性鉴定等手段，进一步证明了花椒具有无融合生殖特性，并筛选出参与无融合胚胎发生的候选基因。此外，Wang等[11]对花椒无融合生殖的分子机制提出了新的见解，并基于基因组、转录组和代谢组技术对花椒属植物的两种生物碱的生物合成、无融合生殖及其抗旱特性进行了深入研究。

雌雄同株是指一个植物体上既有雌花又有雄花的现象，雌雄同株的植物可以自花授粉，也可以异花授粉，这种特性在植物繁殖策略中具有一定的优势[16]。笔者在进行顶坛花椒种质资源调查和品种选育的过程中，连续6年进行观察，发现顶坛花椒大多为纯雌株，部分顶坛花椒园中存在5%～10%着生雄花的植株，且出现雌雄同株的现象，同时花粉具有活力，这与上述学者的研究结果有所不同。鉴于此，笔者连续2年在顶坛花椒花期采集样品，采用生物学显微镜、扫描电镜及TTC染色法对具有代表性的顶坛花椒单株雄花形态构造、花粉形态指标及花粉活力等进行研究，以期为顶坛花椒的发育生物学理论及杂交育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于贵州省贞丰县北盘江镇，地处珠江水系西江上源北盘江畔，属喀斯特地貌地区，海拔550～1470 m，该地区属北亚热带高原季风湿润气候，气候温和，年均温16.4 ℃，全年无霜期335 d，雨量充沛，年均降水量1300 mm，雨热基本同季，年均日照时数1549 h，年均相对湿度81%，土壤以石灰土为主。

1.2 样品采集及保存

2021年3月至2022年3月，选择具有代表性的5株雌雄同株（编号1～5号）顶坛花椒，从树冠的不同方向采集正处于顶坛花椒盛花期的成熟花朵。将样品放置于恒温箱中干燥3 h，散粉后取下花粉，放置于铺有滤纸的培养皿中，于4 ℃冰箱保存备用。

试验地顶坛花椒不同单株见图1，其中1～4号（图1-A～D）单株的树龄为12年生，5号（图1-E）的树龄为2年生，在连续两年的观察中发现都有少数的雄花出现，且均为雌雄同株。1号顶坛花椒的植株长势较弱，表现出衰弱迹象，2号顶坛花椒一半有雄花，一半无雄花，同时发现开雄花的枝条长势比无雄花的枝条长势弱，3号和4号也出现同样的情况，但5号顶坛花椒幼株，开完雄花后植株长势正常。

1.3 研究方法

1.3.1 显微镜及扫描电镜观察 采用Eclipse E200生物学显微镜对花朵进行形态观察。将保存备用的样品用软毛刷轻微蘸取微量花粉，轻扫于电镜的固定液中，摇匀，在室温下固定2 h，再放置于4 ℃冰箱保存。固定好之后，使用0.1 mol·L-1的PB（磷酸）缓冲液清洗3次，每次15 min；依次经过不同浓度（φ，后同）的酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）进行脱水，再放置于干燥器皿内干燥，将干燥后的样品在ETD-900M磁控离子溅射仪中喷金30 s左右，置于EM-30 Plus超高分辨率台式扫描电镜下，选择有代表性的视野观察花粉的形态特征，随机选取10粒花粉进行测量。

1.3.2 花粉活力检测 采用亚历山大染色法进行花粉活力检测[17]。使用毛笔将花粉粒轻轻刷到载玻片上，并用滴管滴加亚历山大染料溶液染色5～10 h，然后在显微镜下观察、统计，原生质呈现红色且花粉壁呈现绿色的花粉具有活力，均呈现绿色的则为无活力或发育不良花粉。观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉活力。花粉活力/%=红色花粉粒数/花粉粒总数×100。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2007进行统计分析，用AutoCAD 2022测量花粉的形态指标，包括极轴长（P）、赤道轴长（E）、极赤比（P/E）和网孔直径，P×E为花粉的大小；参照《孢粉学概论》[6]，0.88＜P/E＜1.14为圆球形，1.14≤P/E＜1.33为近长球形，1.33≤P/E＜2.00为长球形，P/E≥2.00为超长球形。利用Origin 2020b软件进行形态指标的差异显著性分析。