药食同源蔬菜赤苍藤SCoT分子标记体系的优化及引物筛选

药食同源蔬菜赤苍藤SCoT分子标记

体系的优化及引物筛选

杨天为1，黄诗宇1，张尚文1，高曼熔2，张向军1，

李 婷1，庾韦花1，蒙 平1，石 前1

（1.广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所 南宁 530007； 2.广西大学农学院 南宁 530004）

摘    要：笔者以24份不同来源地的野生赤苍藤种质为试验材料，采用L9（33）正交试验对赤苍藤SCoT-PCR反应体系进行优化，并通过优化后的体系进行引物筛选，结果表明，PCR体系中各因素对多态性结果的影响程度排序为DNA模板量>引物用量>2×Taq Master Mix用量。最佳反应体系（20 μL）为1 μL DNA模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL引物（10 μmoL·μL-1）、10 μL 2×Taq Master Mix和7.8 μL ddH2O。通过该体系从36条SCoT引物中筛选出14条稳定性好、多态性高的引物，并确定了最佳退火温度。该体系的建立和引物的筛选将为后续开展赤苍藤种质资源收集与保护、遗传多样性研究和分子育种提供参考依据。

关键词：赤苍藤；SCoT-PCR；体系优化；引物筛选

中图分类号：S567.1+9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）01-048-05

Optimization of scot molecular marker system and primer screening of Erythropalum scandens Bl.-A vegetable of affinal drug and diet

YANG Tianwei1，HUANG Shiyu1，ZHANG Shangwen1，GAO Manrong2，ZHANG Xiangjun1，LI Ting1，YU Weihua1，MENG Ping1，SHI Qian1

（1. Biotechnology Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Science， Nanning 530007， Guangxi， China; 2. Agricultural College of Guangxi University， Nanning 530004， Guangxi， China）

Abstract：In this study， the SCoT-PCR reaction system of Erythropalum scandens Bl. was optimized by L9（33）orthogonal design，and 24 samples from different origins were used as experimental materials for primer screening and system verification. The factors affecting polymorphism were listed as follows， the amount of DNA template > the amount of primers > the amount of 2×Taq Master Mix， and the best reaction system（20 μL）was 1 μL DNA template（50 ng·μL-1）， 1.2 μL primer（10 μmoL·μL-1）， 10 μL 2×Taq Master Mix and 7.8 μL ddH2O. Totally 14 primers with good stability and high polymorphism were selected from 36 SCoT primers， and the optimal renaturation temperature was determined. The establishment of the system and the screening of primers will provide a reference for the subsequent collection and protection of germplasm resources， genetic diversity research and molecular breeding of Erythropalum scandens.

Key words：Erythropalum scandens Blume; SCoT-PCR; System optimization; Primers screening

赤苍藤（Erythropalum scandens Blume）为铁青树科赤苍藤属多年生常绿大型木质藤本植物，又称牛耳藤、萎藤、勾华、侧苋、细绿藤，主要分布在热带及亚热带地区，主产地位于华南地区以及贵州、云南等地的中低海拔区域。赤苍藤作为一种药用植物被收录在《广西药用植物名录》[1]中，它也是一种药食兼用的天然野生植物，嫩叶可作鲜食蔬菜，营养价值丰富、口味鲜美、清香独特；茎、根可作药材，茎可利尿医黄疸、治疗风湿骨痛，根可祛水肿，治疗跌打损伤[2]。近年来，随着赤苍藤的食用和药用价值获得人们认可，市场需求也日益增长，而我国热带和亚热带地区具有丰富的赤苍藤野生资源，有很大的开发潜力，目前，有关赤苍藤的研究主要是生产栽培技术[3-4]、品种选育[5]、化学成分分析[6-7]与药理作用[8]等方面，而有关赤苍藤种质资源评价与分类、遗传结构分析等方面的研究还未见报道，因此，对赤苍藤开展种质间遗传特性的深入研究可以为赤苍藤种质资源的收集与保护、品种选育与改良提供理论依据，对推进产业快速发展具有重要意义。

分子标记已经成为研究生物个体间遗传多样性的重要手段之一，较常用的分子标记方法有SSR、ISSR、SCoT和AFLP等[9-10]，其中SCoT标记是根据基因组中ATG翻译起始位点的侧翼有一段短的保守序列的原理进行引物设计，是一种通过单引物扩增目的基因的功能性分子标记[11]，正是因为这一原理，其与许多功能基因能够形成较多的引物结合位点，扩增的序列介于外显子与内含子之间，大幅度提升了引物的多态性。SCoT与其他分子标记手段相比，SCoT标记技术与供试材料的功能基因密切相关，更能反映相关功能性状的多态性，且所用引物简单、通用性强、扩增的条带稳定且多态性高，扩增产物能够通过琼脂糖凝胶电泳检测，操作简单方便、成本低，已经广泛应用在植物的遗传多样性、亲缘关系研究、种质资源鉴定与指纹图谱的构建等方面的研究中[10]。目前，SCoT分子标记已经成功应用于龙眼[12]、芥菜[13]、葡萄[14]、葛根[15]、铁皮石斛[16]等植物的遗传多样性研究。

笔者以24份不同来源地的野生赤苍藤种质为材料，通过正交试验设计方法建立并优化赤苍藤SCoT-PCR反应体系，从SCoT引物中筛选出稳定性好、多态性高、条带清晰的引物，为赤苍藤SCoT分子标记的应用研究奠定基础，同时也为今后赤苍藤种质资源评价、遗传多样性分析以及种质资源鉴定等方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2022年4月在广西壮族自治区农业科学院科研实验楼进行，试验材料为随机抽取的24份不同来源地的野生赤苍藤种质（表1），进行PCR体系优化与引物筛选，引物采用Collard和Mackill公布的SCoT分子标记引物SCoT-1～SCoT-36[11]，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 采用Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒（BSC13S1B，杭州博日科技股份有限公司）提取不同来源地的赤苍藤叶片的DNA，使用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，提取的赤苍藤DNA在-20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 SCoT-PCR反应体系优化 使用预扩增效果较好的SCoT-1引物、Es 24赤苍藤DNA模板，对SCoT-PCR反应体系中DNA模板量、引物、2×Es Taq Master Mix（CW0690M，康为世纪生物科技股份有限公司）3个影响因素进行优化，每个因素设置3个水平，采用L9（33）正交试验（表2），每个处理2次重复。PCR扩增程序设置为：94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 30 s变性，57 ℃ 30 s复性，72 ℃ 30 s延伸，35次循环；72 ℃ 5 min总延伸；反应体系为20 μL，DNA模板、引物、2×Es Taq Master Mix用量按正交试验表添加，剩余用ddH2O补足，PCR反应结束后使用1.0%的琼脂糖凝胶检测扩增产物，拍照分析各反应条件的扩增效果。正交试验结果通过直观分析法[17]进行分析，根据扩增条带数量、清晰程度等进行评分，满分为9分，分值越高代表扩增效果越好。计算每个因素不同水平下的评分平均值Ki，并求出同一因素不同水平间的评分平均值的极差R，R值越大表示影响程度越大，最终筛选出最适合的反应条件。

1.2.3 引物初筛和退火温度筛选 以Es24赤苍藤DNA为模板，SCoT-1～SCoT-36为引物，使用优化后的SCoT-PCR反应体系进行初步筛选，并对初筛结果中扩增条带不清晰的引物设置退火温度梯度（48、51、53、57、60、63 ℃）进行复筛。挑选2轮筛选中条带清晰，多态性高的引物用于SCoT-PCR反应体系验证。

1.2.4 SCoT-PCR反应体系验证 从筛选到的条带清晰、多态性高的引物中随机挑选3个引物对24份赤苍藤DNA模板验证筛选出的最佳反应体系，用1.0%的琼脂糖凝胶检测结果。

1.3 数据处理

使用SPSS 22.0生成三因素三水平正交试验表，通过Excel 2016计算平均值Ki和极差R。

2 结果与分析

2.1 SCoT-PCR反应体系优化结果

通过PCR扩增结果（图1）看出不同的正交组合扩增的条带有较大差异，条带数量，清晰程度均有不同，其中处理8的扩增效果最好，评分结果如表3所示，通过R值判断3个因素对赤苍藤SCoT-PCR反应体系的影响程度排序为：DNA模板量>引物用量>Mix混合液用量，通过Ki值确定最优反应体系（20.0 μL）为1.0 μL DNA模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL引物（10 μmoL·μL-1）、10.0 μL Mix混合液和7.8 μL ddH2O。

2.2 引物初筛与退火温度筛选结果

通过对SCoT-1～SCoT-36引物的初步筛选以及部分引物退火温度的复筛，由图2可知，不同退火温度对PCR扩增的结果影响较大，退火温度越高，扩增的条带越少，不同引物的最适退火温度也不相同。以背景清晰、条带明亮、数量多的扩增结果确定最佳退火温度，淘汰各个退火温度下扩增效果均不太好的引物，最终确定表4引物和退火温度适用于赤苍藤材料的SCoT-PCR反应。

2.3 SCoT-PCR反应体系验证结果

在筛选出的SCoT引物中随机挑选了SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22引物进行SCoT-PCR反应体系验证（表4），以24份不同来源地的赤苍藤材料DNA为模板，随机挑选的3条引物均能扩增出背景清晰、多态性丰富的条带（图3），不同来源地的赤苍藤的扩增条带能够体现出差异，其中SCoT-2共扩增11个位点，多态性位点11个；SCoT-11共扩增10个位点，多态性位点6个；SCoT-22共扩增11个位点，多态性位点9个。结果表明，该SCoT-PCR反应体系稳定可靠，可用于赤苍藤的SCoT分子标记。